Anwendungen

Experimentenziele
Erfahren Sie durch Experimente die Grundprinzipien der chromatographischen Analyse und den Grundbetrieb des Instruments und verstehen Sie den Prozess der Datenanalyse.
Erfahren Sie mehr über chromatographische quantitative Methoden und vergleichen Sie die Vor- und Nachteile verschiedener Methoden.

HPLC EINLEITUNG
Hohe Geschwindigkeit: HPLC verwendet Hochdruck-Infusionsgeräte, die Durchflussrate wird stark erhöht und die Analysegeschwindigkeit ist extrem schnell, nur wenige Minuten im Allgemeinen.
Effizient: Die Füllstoffpartikel sind sehr fein und regelmäßig, die Beschichtung in der stationären Phase ist gleichmäßig und der Massenübergangswiderstand ist gering, sodass die Säuleneffizienz sehr hoch ist.
Hochempfindlichkeit: Der Detektor ist extrem empfindlich: UV-10-9g, Fluoreszenzdetektor- 10- 11g.

Vergleich HPLC mit GC

Objekt und Analyseumfang: Die GC-Analyse beschränkt sich auf Gase und stabile Verbindungen mit niedrigem Kochbus, die nur 20% der gesamten organischen Substanz ausmachen.

Die Auswahl der mobilen Phase: GC verwendet begrenzte optionale Arten von „inerten“ Gasen als mobile Phase, nur geringe Auswirkungen auf Komponenten.

Betriebstemperatur: GC erfordert hohe Temperaturen;
Anwendungsfelder
Aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit, der quantitativen Genauigkeit und seiner Analyse nicht flüchtiger und thermisch instabiler Komponenten ist die HPLC-Trennungsanalyse in der industriellen und wissenschaftlichen Forschung äußerst vielseitig, insbesondere in Biologie und Medizin.

HPLC -Struktur und Prinzip

Abb. 1 HPLC -Struktur

HPLC besteht aus Pumpensystem, Injektionssystem, Trennsystem, Detektor und Datenverarbeitungssystem.

Hochdruck-Infusionssystem
1) Mobile phase bottle: 1-2L glass bottle with solvent filter (Ni alloy), its pores are approximately 2 μm, preventing particulates from pumping.
2) Entgasser: Ultraschall entgasend oder Vakuumheizungsentgasung.

3) Hochdruckpumpe: Die Anforderungen an die Infusionspumpe: gute Versiegelung, stabiler Strömung ohne Zustrom, breiter einstellbarer Bereich und Korrosionsbeständigkeit.

Injektionssystem

Manueller Injektor oder Auto-Sampller

Abb.2 Injektionsprinzip

Säulentrennsystem

Abb.2 Trennungsprinzip

Abb.3 UVD

Trennungsprinzip
Chromatographischer Prozess: In Systemen mit zwei nicht mischbaren Phasen, der mobilen Phase und der stationären Phase, ist die dritte Komponente (dh der gelöste Stoff oder Adsorbat) kontinuierlich wechselnde Verteilung zwischen den beiden Phasen.
Aufgrund der Unterschiede in der Eigenschaft der mobilen Phase, der stationären Phase und des gelösten Gemischs zeigen die Komponenten während des chromatographischen Prozesses unterschiedliche chromatographische Verhaltensweisen, so dass die Komponenten voneinander getrennt sind.

Auflösung

Die Auflösung einer Elution ist ein quantitatives Maß dafür, wie gut zwei Elutionspeaks in einer chromatographischen Trennung differenziert werden können.

Korrekturfaktor
The quantitative analysis of chromatography is based on that the amount of component is proportional to the peak area：

Weight correction factor：

Quantitative Methode
Externe Standardmethode
Die Kalibrierungskurve kann gemäß den folgenden Gleichungen festgelegt werden:

Angewendet auf die reguläre Analyse
Vorteile: Einfacher Betrieb und Berechnung
Mangel: Die Genauigkeit der Ergebnisse hängt von der Wiederholbarkeit der Injektion und der Stabilität der Betriebsbedingungen ab.

Internal standard method

Add certain amount of pure substance into the sample as internal standard.

Anwendungsbereich: Bestimmen Sie nur mehrere Komponenten der Probe, und nicht alle Peaks von Komponenten können fließen
Vor-
Mangel: für schnelle Analyse nicht geeignet.

Spritze

Die Nadel der GC -Spritze ist scharf und die Nadel der LC -Spritze ist flach.

Experiment

Versuchsbedingungen
1)Inject 10μL mix standard solutions (methyl paraben, propyl paraben, and butyl paraben) in different ratio mobile phases of methanol:water = 90:10, 80:20, and 70:30 to test, record retention time and the resolution between the various components, with the resolution greater than 1.5 and the shortest retention time as the principle of selecting the best mobile phase matching ratio.
Hinweis: Jedes Mal, wenn Sie die mobile Phase ändern, müssen Sie etwa 5 Minuten warten, um das chromatographische System auszugleichen (sowohl Signal- als auch Druckleitungen sind ausgeglichen).
2) Inject 10 μL mix standard solutions (methyl paraben, propyl paraben, and butyl paraben) at different mobile phase flow rates of 0.8, 1.0, and 1.5 mL/min and optimal mobile phase ratios injection analysis, the same principle selected the best mobile phase flow rate.

Qualitative Analyse
Under the optimal experimental conditions, inject 10 μL each of methyl paraben, propyl paraben, and butyl paraben and the retention time of each peak is recorded. Compared with the result obtained in step 2).

Quantitative Analyse
Kalibrierungskurve
Under the optimal experimental conditions, 2, 5, 8, 10, 15, and 20 μL of the mixed standard sample was injected and analyzed, and the standard curve is established by injection volume and peak area.
Es ist erforderlich, dass der Korrelationskoeffizient dieser Kurve größer als 0,99 ist.

Unbekannte Probenanalyse
Inject 10 μL unknown sample to test, quantitative analysis by calibration curve. After analysis, wash the HPLC system with pure methanol about 10min, then shut off workstation and power switch.

Fragen
Basierend auf den experimentellen Daten diskutieren Sie die Unterschiede in den Analysemethoden zwischen der Gaschromatographie und der Flüssigchromatographie.
Erforschen Sie den Anwendungswert der HPLC -Analyse.
Ob der UV -Detektor zum Nachweis aller organischen Verbindung geeignet ist?