Aplikasi

Tujuan Eksperimen
Dengan eksperimen, pelajari prinsip -prinsip dasar analisis kromatografi dan operasi dasar instrumen, dan pahami proses analisis data.
Pelajari tentang metode kuantitatif kromatografi dan bandingkan kelebihan dan kekurangan metode yang berbeda.

PENDAHULUAN HPLC
Kecepatan tinggi: HPLC menggunakan peralatan infus bertekanan tinggi, laju aliran sangat meningkat, dan kecepatan analisis sangat cepat, hanya beberapa menit secara umum;
Efisien: Partikel pengisi sangat halus dan teratur, lapisan pada fase stasioner seragam, dan resistansi transfer massa kecil, sehingga efisiensi kolom sangat tinggi.
Sensitivitas Tinggi: Detektor sangat sensitif: UV- 10-9G, Detektor Fluoresensi- 10-11G.

Perbandingan HPLC dengan GC

Objek dan ruang lingkup analisis: Analisis GC terbatas pada gas dan senyawa stabil yang mendidih rendah, yang hanya menyumbang 20% ​​dari total bahan organik;

Pilihan fase gerak: GC menggunakan jenis gas "inert" opsional terbatas sebagai fase gerak, hanya membawa, efek kecil pada komponen.

Suhu operasi: GC membutuhkan suhu tinggi;
Bidang aplikasi
Karena sensitivitasnya yang tinggi, akurasi kuantitatif, dan cocok untuk analisis komponen non-volatil dan tidak stabil, analisis pemisahan HPLC sangat fleksibel dalam penelitian industri dan ilmiah, terutama dalam biologi dan kedokteran.

Struktur dan Prinsip HPLC

Gbr. 1 Struktur HPLC

HPLC terdiri dari sistem pompa, sistem injeksi, sistem pemisahan, sistem pemrosesan detektor dan data.

Sistem infus bertekanan tinggi
1) Mobile phase bottle: 1-2L glass bottle with solvent filter (Ni alloy), its pores are approximately 2 μm, preventing particulates from pumping.
2) Degasser: Degassing ultrasonik atau pemanas vakum degassing.

3) Pompa bertekanan tinggi: Persyaratan untuk pompa infus: penyegelan yang baik, aliran stabil tanpa masuknya, rentang yang dapat disesuaikan lebar, dan resistensi korosi.

Sistem Injeksi

Injektor manual atau sampel otomatis

Gbr.2 Prinsip Injeksi

Sistem Pemisahan Kolom

Gbr.2 Prinsip Pemisahan

Gbr.3 UVD

Prinsip Pemisahan
Proses kromatografi: Dalam sistem dengan dua fase yang tidak dapat dicukur, fase gerak dan fase stasioner, komponen ketiga (yaitu zat terlarut atau adsorbat) adalah distribusi alternatif yang terus menerus antara kedua fase.
Karena perbedaan dalam properti fase gerak, fase diam, dan campuran zat terlarut, komponen menunjukkan perilaku kromatografi yang berbeda selama proses kromatografi, sehingga komponen dipisahkan satu sama lain.

Resolusi

Resolusi elusi adalah ukuran kuantitatif tentang seberapa baik dua puncak elusi dapat dibedakan dalam pemisahan kromatografi.

Faktor koreksi
The quantitative analysis of chromatography is based on that the amount of component is proportional to the peak area：

Weight correction factor：

Metode kuantitatif
Metode Standar Eksternal
Kurva kalibrasi dapat ditetapkan sesuai dengan persamaan berikut:

Diterapkan pada analisis reguler
Keuntungan: Operasi dan Perhitungan Mudah
Kekurangan: Keakuratan hasil tergantung pada pengulangan injeksi dan stabilitas kondisi operasi.

Internal standard method

Add certain amount of pure substance into the sample as internal standard.

Rentang Aplikasi: Hanya tentukan beberapa komponen sampel, dan tidak semua puncak komponen dapat dialihkan
Keuntungan: lebih sedikit pengaruh kondisi operasi, jauh preciser, dan lebih sedikit pembatasan daripada metode normalisasi, cocok untuk analisis jejak
Kekurangan: Tidak layak untuk analisis cepat.

Jarum suntik

Jarum jarum suntik GC tajam dan jarum jarum suntik LC datar.

Percobaan

Kondisi eksperimental
1)Inject 10μL mix standard solutions (methyl paraben, propyl paraben, and butyl paraben) in different ratio mobile phases of methanol:water = 90:10, 80:20, and 70:30 to test, record retention time and the resolution between the various components, with the resolution greater than 1.5 and the shortest retention time as the principle of selecting the best mobile phase matching ratio.
Catatan: Setiap kali Anda mengubah fase seluler, Anda harus menunggu sekitar 5 menit untuk menyeimbangkan sistem kromatografi (baik saluran sinyal dan tekanan seimbang).
2) Inject 10 μL mix standard solutions (methyl paraben, propyl paraben, and butyl paraben) at different mobile phase flow rates of 0.8, 1.0, and 1.5 mL/min and optimal mobile phase ratios injection analysis, the same principle selected the best mobile phase flow rate.

Analisis Kualitatif
Under the optimal experimental conditions, inject 10 μL each of methyl paraben, propyl paraben, and butyl paraben and the retention time of each peak is recorded. Compared with the result obtained in step 2).

Analisis kuantitatif
Kurva kalibrasi
Under the optimal experimental conditions, 2, 5, 8, 10, 15, and 20 μL of the mixed standard sample was injected and analyzed, and the standard curve is established by injection volume and peak area.
Diperlukan bahwa koefisien korelasi kurva ini lebih besar dari 0,99.

Analisis sampel yang tidak diketahui
Inject 10 μL unknown sample to test, quantitative analysis by calibration curve. After analysis, wash the HPLC system with pure methanol about 10min, then shut off workstation and power switch.

Pertanyaan
Berdasarkan data eksperimental, diskusikan perbedaan dalam metode analisis antara kromatografi gas dan kromatografi cair.
Jelajahi nilai aplikasi analisis HPLC.
Apakah detektor UV cocok untuk mendeteksi semua senyawa organik?