Aplicaciones

Objetivos del experimento
Mediante experimentos, aprenda los principios básicos del análisis cromatográfico y el funcionamiento básico del instrumento, y comprenda el proceso de análisis de datos.
Aprenda sobre métodos cuantitativos cromatográficos y compare las ventajas y desventajas de diferentes métodos.

Introducción de HPLC
Alta velocidad: HPLC utiliza equipos de infusión de alta presión, el caudal aumenta considerablemente y la velocidad de análisis es extremadamente rápida, solo unos pocos minutos en general;
Eficiente: las partículas de relleno son muy finas y regulares, el recubrimiento en la fase estacionaria es uniforme y la resistencia a la transferencia de masa es pequeña, por lo que la eficiencia de la columna es muy alta.
Alta sensibilidad: el detector es extremadamente sensible: UV- 10-9G, detector de fluorescencia- 10-11g.

Comparación HPLC con GC

Objeto y alcance del análisis: el análisis de GC se limita a gases y compuestos estables de bajo hazling, que representan solo el 20% de la materia orgánica total;

La elección de la fase móvil: GC utiliza tipos opcionales limitados de gases "inertes" como la fase móvil, solo transporta, un pequeño efecto en los componentes.

Temperatura de funcionamiento: GC requiere altas temperaturas;
Campos de aplicación
Debido a su alta sensibilidad, precisión cuantitativa y adecuado para el análisis de componentes no volátiles y térmicamente inestables, el análisis de separación de HPLC es extremadamente versátil en la investigación industrial y científica, especialmente en biología y medicina.

Estructura y principio de HPLC

Fig. 1 Estructura HPLC

HPLC consiste en sistema de bomba, sistema de inyección, sistema de separación, detector y sistema de procesamiento de datos.

Sistema de infusión de alta presión
1) Botella de fase móvil: botella de vidrio 1-2L con filtro de solvente (aleación de Ni), sus poros son de aproximadamente 2 μm, evitando que las partículas bombeen.
2) Desgase: desgasificación ultrasónica o desgasificación de calentamiento de vacío.

3) Bomba de alta presión: los requisitos para la bomba de infusión: buen sellado, flujo estable sin afluencia, amplio rango ajustable y resistencia a la corrosión.

Sistema de inyección

Inyector manual o autoampler

Fig.2 Principio de inyección

Sistema de separación de columnas

Fig.2 Principio de separación

Fig.3 UVD

Principio de separación
Proceso cromatográfico: en sistemas con dos fases inmiscibles, la fase móvil y la fase estacionaria, el tercer componente (es decir, el soluto o el adsorbato) es continuamente la distribución alternativa entre las dos fases.
Debido a las diferencias en la propiedad de la fase móvil, la fase estacionaria y la mezcla de soluto, los componentes muestran diferentes comportamientos cromatográficos durante el proceso cromatográfico, de modo que los componentes se separan entre sí.

Resolución

La resolución de una elución es una medida cuantitativa de qué tan bien se pueden diferenciar dos picos de elución en una separación cromatográfica.

Factor de corrección
El análisis cuantitativo de la cromatografía se basa en que la cantidad de componente es proporcional al área máxima:

Factor de corrección de peso:

Método cuantitativo
Método estándar externo
La curva de calibración se puede establecer de acuerdo con las siguientes ecuaciones:

Aplicado al análisis regular
Ventajas: operación y cálculo fáciles
Escasez: la precisión de los resultados depende de la repetibilidad de la inyección y la estabilidad de las condiciones de funcionamiento.

Método estándar interno

Agregue cierta cantidad de sustancia pura a la muestra como estándar interno.

Rango de aplicación: solo determine varios componentes de la muestra, y no todos los picos de los componentes se pueden fluir
Ventajas: menos influencia de las condiciones de funcionamiento, mucho precisor y menos restricciones que el método de normalización, apto para el análisis de rastreo
Escasez: no apto para un análisis rápido.

Jeringuilla

La aguja de la jeringa GC es aguda y la aguja de la jeringa LC es plana.

Experimento

Condiciones experimentales
1) Inyectar 10 μl de soluciones estándar de mezcla (metilo parabeno, propil paraben y butil paraben) en diferentes fases móviles de metanol: agua = 90:10, 80:20 y 70:30 para probar, registrar el tiempo de retención y la resolución entre los diversos componentes, con la resolución mayor que 1.5 y el tiempo de retención más corto como el tiempo de selección de la mejor fase móvil.
Nota: Cada vez que cambia la fase móvil, debe esperar unos 5 minutos para equilibrar el sistema cromatográfico (tanto las líneas de señal como de presión están equilibradas).
2) Inyectar 10 μl de soluciones estándar de mezcla (metil parabeno, propil paraben y butil paraben) a diferentes tasas de flujo de fase móvil de 0.8, 1.0 y 1.5 ml {{url_placeholder_0}} y análisis de inyección de relaciones de fase móvil óptimas, el mismo principio seleccionó el mejor tasa de flujo de fase móvil.

Análisis cualitativo
Bajo las condiciones experimentales óptimas, inyectar 10 μl cada uno de metilo parabeno, parabeno de propil y butilo y el tiempo de retención de cada pico se registra.

Análisis cuantitativo
Curva de calibración
Bajo las condiciones experimentales óptimas, se inyectaron y analizaron 2, 5, 8, 10, 15 y 20 μl de la muestra estándar mixta, y la curva estándar se establece mediante el volumen de inyección y el área máxima.
Se requiere que el coeficiente de correlación de esta curva sea mayor que 0.99.

Análisis de muestra desconocido
Inyectar 10 μl de muestra desconocida para probar el análisis cuantitativo por curva de calibración.

Preguntas
Basado en los datos experimentales, discuta las diferencias en los métodos de análisis entre la cromatografía de gases y la cromatografía líquida.
Explore el valor de la aplicación del análisis HPLC.
¿Si el detector UV es adecuado para detectar todo el compuesto orgánico?