Başvuru

Deney hedefleri
Deneylerle, kromatografik analizin temel prensiplerini ve cihazın temel çalışmasını öğrenin ve veri analizi sürecini anlayın.
Kromatografik kantitatif yöntemler hakkında bilgi edinin ve farklı yöntemlerin avantajlarını ve dezavantajlarını karşılaştırın.

HPLC Giriş
Yüksek hız: HPLC, yüksek basınçlı infüzyon ekipmanı kullanır, akış hızı büyük ölçüde artar ve analiz hızı son derece hızlıdır, sadece birkaç dakikadır;
Verimli: Dolgu parçacıkları çok ince ve düzenli, sabit fazdaki kaplama eşittir ve kütle transfer direnci küçüktür, bu nedenle kolon verimliliği çok yüksektir.
Yüksek duyarlılık: Dedektör son derece hassastır: UV-10-9G, floresan dedektörü- 10-11g.

GC ile karşılaştırma HPLC

Nesne ve analiz kapsamı: GC analizi, toplam organik maddenin sadece% 20'sini oluşturan gazlar ve düşük kaynayan stabil bileşiklerle sınırlıdır;

Mobil aşama seçimi: GC, mobil faz olarak sınırlı isteğe bağlı “inert” gaz türleri kullanır, sadece taşıma, bileşenler üzerinde küçük bir etki kullanır.

Çalışma sıcaklığı: GC yüksek sıcaklıklar gerektirir;
Uygulama alanları
Yüksek hassasiyeti, nicel doğruluğu ve uçucu olmayan ve termal olarak kararsız bileşenlerin analizi için uygun olması nedeniyle, HPLC ayırma analizi endüstriyel ve bilimsel araştırmalarda, özellikle biyoloji ve tıpta son derece çok yönlüdür.

HPLC yapısı ve prensibi

Şekil 1 HPLC yapısı

HPLC, pompa sistemi, enjeksiyon sistemi, ayırma sistemi, dedektör ve veri işleme sisteminden oluşur.

Yüksek basınçlı infüzyon sistemi
1) Mobile phase bottle: 1-2L glass bottle with solvent filter (Ni alloy), its pores are approximately 2 μm, preventing particulates from pumping.
2) DeGaser: Ultrasonik Gazetme veya Vakum Isıtma Gazbesi.

3) Yüksek basınçlı pompa: infüzyon pompası için gereksinimler: iyi sızdırmazlık, akışsız kararlı akış, geniş ayarlanabilir aralık ve korozyon direnci.

Enjeksiyon sistemi

Manuel enjektör veya otomatik sümüklü

Şekil 2 Enjeksiyon prensibi

Sütun ayırma sistemi

Şekil 2 Ayırma İlkesi

Şekil 3 UVD

Ayrılık ilkesi
Kromatografik işlem: Mobil faz ve sabit faz olan iki karışmaz fazı olan sistemlerde, üçüncü bileşen (yani çözünen veya adsorbat), iki faz arasında sürekli olarak alternatif dağılımdır.
Mobil fazın özelliğindeki farklılıklar, sabit faz ve çözünen karışım nedeniyle, bileşenler kromatografik işlem sırasında farklı kromatografik davranışlar gösterir, böylece bileşenler birbirinden ayrılır.

Çözünürlük

Bir elüsyonun çözünürlüğü, iki elüsyon zirvesinin bir kromatografik ayrılıkta ne kadar iyi farklılaşabileceğinin nicel bir ölçüsüdür.

Düzeltme faktörü
The quantitative analysis of chromatography is based on that the amount of component is proportional to the peak area：

Weight correction factor：

Nicel yöntem
Harici standart yöntem
Kalibrasyon eğrisi aşağıdaki denklemlere göre kurulabilir:

Düzenli analize uygulandı
Avantajlar: Kolay çalışma ve hesaplama
Kıtlık: Sonuçların doğruluğu, enjeksiyonun tekrarlanabilirliğine ve çalışma koşullarının stabilitesine bağlıdır.

Internal standard method

Add certain amount of pure substance into the sample as internal standard.

Uygulama Aralığı: Sadece numunenin birkaç bileşenini belirleyin ve bileşenlerin tüm pikleri akmaz
Avantajlar: Çalışma koşullarının daha az etkisi, çok önleyici ve normalleştirme yönteminden daha az kısıtlamalar, iz analizine uygun
Kıtlık: Hızlı analiz için uygun değil.

Şırınga

GC şırıngasının iğnesi keskindir ve LC şırıngasının iğnesi düzdür.

Deney

Deney koşulları
1)Inject 10μL mix standard solutions (methyl paraben, propyl paraben, and butyl paraben) in different ratio mobile phases of methanol:water = 90:10, 80:20, and 70:30 to test, record retention time and the resolution between the various components, with the resolution greater than 1.5 and the shortest retention time as the principle of selecting the best mobile phase matching ratio.
Not: Mobil aşamayı her değiştirdiğinizde, kromatografik sistemi dengelemek için yaklaşık 5 dakika beklemeniz gerekir (hem sinyal hem de basınç çizgileri dengelidir).
2) Inject 10 μL mix standard solutions (methyl paraben, propyl paraben, and butyl paraben) at different mobile phase flow rates of 0.8, 1.0, and 1.5 mL/min and optimal mobile phase ratios injection analysis, the same principle selected the best mobile phase flow rate.

Nitel analiz
Under the optimal experimental conditions, inject 10 μL each of methyl paraben, propyl paraben, and butyl paraben and the retention time of each peak is recorded. Compared with the result obtained in step 2).

Kantitatif analiz
Kalibrasyon eğrisi
Under the optimal experimental conditions, 2, 5, 8, 10, 15, and 20 μL of the mixed standard sample was injected and analyzed, and the standard curve is established by injection volume and peak area.
Bu eğrinin korelasyon katsayısının 0.99'dan büyük olması gerekir.

Bilinmeyen örnek analizi
Inject 10 μL unknown sample to test, quantitative analysis by calibration curve. After analysis, wash the HPLC system with pure methanol about 10min, then shut off workstation and power switch.

Soru
Deneysel verilere dayanarak, gaz kromatografisi ve sıvı kromatografisi arasındaki analiz yöntemlerindeki farklılıkları tartışın.
HPLC analizinin uygulama değerini keşfedin.
UV dedektörü tüm organik bileşiği tespit etmek için uygun olup olmadığı?