Objetivos do experimento
Por experimentos, aprenda os princípios básicos da análise cromatográfica e a operação básica do instrumento e compreenda o processo de análise de dados.
Aprenda sobre métodos quantitativos cromatográficos e compare as vantagens e desvantagens de diferentes métodos.
Introdução ao HPLC
Alta velocidade: o HPLC usa equipamentos de infusão de alta pressão, a taxa de fluxo aumenta bastante e a velocidade de análise é extremamente rápida, apenas alguns minutos em geral;
Eficiente: as partículas de enchimento são muito finas e regulares, o revestimento na fase estacionária é uniforme e a resistência à transferência de massa é pequena, portanto a eficiência da coluna é muito alta.
Alta sensibilidade: O detector é extremamente sensível: UV- 10-9G, detector de fluorescência- 10- 11g.
Comparação HPLC com GC
Objeto e escopo da análise: A análise GC é limitada a gases e compostos estáveis de baixo ferimento, que representam apenas 20% da matéria orgânica total;
A escolha da fase móvel: o GC usa tipos opcionais limitados de gases "inertes" como fase móvel, carregam apenas um pequeno efeito nos componentes.
Temperatura operacional: o GC requer altas temperaturas;
Campos de aplicação
Devido à sua alta sensibilidade, precisão quantitativa e adequada para análise de componentes não voláteis e termicamente instáveis, a análise de separação de HPLC é extremamente versátil em pesquisas industriais e científicas, especialmente em biologia e medicina.
O HPLC consiste no sistema de bomba, sistema de injeção, sistema de separação, sistema de processamento de detector e dados.
Sistema de infusão de alta pressão
1) garrafa de fase móvel: garrafa de vidro 1-2L com filtro de solvente (liga Ni), seus poros são de aproximadamente 2 μm, impedindo que as partículas bombearem.
2) DeGasser: desgaseificação ultrassônica ou desgaseificação de aquecimento a vácuo.
3) Bomba de alta pressão: os requisitos para a bomba de infusão: boa vedação, fluxo estável sem influxo, ampla faixa ajustável e resistência à corrosão.
Experimentar
Condições experimentais
1) Injetar soluções padrão de mix de 10μl (metil parabeno, propil parabeno e butil parabeno) em diferentes fases móveis de metanol: água = 90:10, 80:20 e 70:30 para testar o tempo de retenção e a retenção e a resolução entre os vários componentes, com a melhor revolução que 1.5 e o tempo mais curto de retenção.
Nota: Cada vez que você altera a fase móvel, você precisa esperar cerca de 5 minutos para equilibrar o sistema cromatográfico (as linhas de sinal e de pressão são equilibradas).
2) Injetar 10 μl de soluções padrão (parabeno metil, propil parabeno e parabeno de butil) em diferentes taxas de fluxo de fase móvel de 0,8, 1,0 e 1,5 ml {{url_placeholder_0}}} e análise ideal da taxa de reflexão da fase móvel, o mesmo princípio selecionado a melhor taxa de fluxo de fase móvel.
Análise qualitativa
Sob as condições experimentais ideais, injete 10 μl de cada um de metil parabeno, propil parabeno e butil paraben e o tempo de retenção de cada pico é registrado.
Análise quantitativa
Curva de calibração
Sob as condições experimentais ideais, 2, 5, 8, 10, 15 e 20 μl da amostra padrão mista foram injetadas e analisadas, e a curva padrão é estabelecida pelo volume de injeção e área de pico.
É necessário que o coeficiente de correlação dessa curva seja maior que 0,99.
Análise de amostra desconhecida
Injete 10 μl de amostra desconhecida para testar, análise quantitativa por curva de calibração.
Questões
Com base nos dados experimentais, discuta as diferenças nos métodos de análise entre cromatografia gasosa e cromatografia líquida.
Explore o valor da aplicação da análise HPLC.
Se o detector UV é adequado para detectar todo o composto orgânico?
