Objectifs de l'expérience
Par expériences, apprenez les principes de base de l'analyse chromatographique et le fonctionnement de base de l'instrument et comprenez le processus d'analyse des données.
Découvrez les méthodes quantitatives chromatographiques et comparez les avantages et les inconvénients de différentes méthodes.
HPLC Introduction
Haute vitesse: HPLC utilise un équipement de perfusion à haute pression, le débit est considérablement augmenté et la vitesse d'analyse est extrêmement rapide, seulement quelques minutes en général;
Efficace: les particules de remplissage sont très fines et régulières, le revêtement sur la phase stationnaire est uniforme et la résistance au transfert de masse est petite, donc l'efficacité de la colonne est très élevée.
Sensibilité élevée: le détecteur est extrêmement sensible: UV-10-9G, détecteur de fluorescence - 10-11G.
Comparaison HPLC avec GC
Objet et portée de l'analyse: L'analyse GC est limitée aux gaz et aux composés stables à faible arborescence, qui ne représentent que 20% de la matière organique totale;
Le choix de la phase mobile: GC utilise des types de gaz «inertes» en option limités comme phase mobile, transportent uniquement, petit effet sur les composants.
Température de fonctionnement: GC nécessite des températures élevées;
Champs d'application
En raison de sa sensibilité élevée, de sa précision quantitative et de sa analyse des composants non volatils et thermiquement instables, l'analyse de séparation HPLC est extrêmement polyvalente dans la recherche industrielle et scientifique, en particulier en biologie et en médecine.
Structure et principe HPLC
Fig. 1 Structure HPLC
HPLC se compose d'un système de pompe, d'un système d'injection, d'un système de séparation, d'un système de traitement des détecteurs et des données.
Système de perfusion à haute pression
1) Bouteille de phase mobile: bouteille en verre 1-2L avec filtre à solvant (alliage Ni), ses pores sont d'environ 2 μm, empêchant les particules de pomper.
2) Dispasser: dégazage à ultrasons ou chauffage sous vide.
3) Pompe à haute pression: les exigences pour la pompe à perfusion: bonne étanchéité, débit stable sans afflux, large plage réglable et résistance à la corrosion.
Système d'injection
Injecteur manuel ou échantillonneur automatique
Fig.2 Principe d'injection
Système de séparation de colonnes
Fig.2 Principe de séparation
Fig.3 UVD
Principe de séparation
Processus chromatographique: Dans les systèmes à deux phases non miscibles, la phase mobile et la phase stationnaire, le troisième composant (c'est-à-dire le soluté ou l'adsorbat) est une distribution en continu entre les deux phases.
En raison des différences de propriété de la phase mobile, de la phase stationnaire et du mélange de soluté, les composants présentent différents comportements chromatographiques pendant le processus chromatographique, de sorte que les composants sont séparés les uns des autres.
Résolution
La résolution d'une élution est une mesure quantitative de la façon dont deux pics d'élution peuvent être différenciés dans une séparation chromatographique.
Facteur de correction
L'analyse quantitative de la chromatographie est basée sur le fait que la quantité de composante est proportionnelle à la zone de pointe:
Facteur de correction du poids:
Méthode quantitative
Méthode standard externe
La courbe d'étalonnage peut être établie en fonction des équations suivantes:
Appliqué à l'analyse régulière
Avantages: fonctionnement facile et calcul
Pénurie: La précision des résultats dépend de la répétabilité de l'injection et de la stabilité des conditions de fonctionnement.
Méthode standard interne
Ajoutez une certaine quantité de substance pure dans l'échantillon comme norme interne.
Plage d'application: déterminer uniquement plusieurs composants de l'échantillon, et tous les pics des composants ne peuvent pas être coulés
Avantages: moins d'influence des conditions de fonctionnement, de l'équipe beaucoup
Pénurie: inapte pour une analyse rapide.
Seringue
L'aiguille de la seringue GC est tranchante et l'aiguille de la seringue LC est plate.
Expérience
Conditions expérimentales
1) Injecter 10 μl de solutions standard de mélange (méthyl paraben, propyl paraben et butyl paraben) dans différentes phases mobiles de rapport de méthanol: eau = 90:10, 80:20 et 70:30 pour tester, enregistrer le temps de rétention et le temps de rétention le plus court comme principe de la sélection des meilleurs ratons de phase mobile.
Remarque: Chaque fois que vous modifiez la phase mobile, vous devez attendre environ 5 minutes pour équilibrer le système chromatographique (les lignes de signal et de pression sont équilibrées).
2) Injecter 10 μl de solutions standard de mélange (méthyl paraben, propyl paraben et butyl paraben) à différents débits de phase mobile de 0,8, 1,0 et 1,5 ml {{url_placeholder_0}} et une analyse d'injection de ratios de phase mobile optimale, le même principe a sélectionné le meilleur débit de phase mobile.
Analyse qualitative
Dans les conditions expérimentales optimales, injectez 10 μL chacune de méthyl paraben, propyl paraben et butyl paraben et le temps de rétention de chaque pic est enregistré.
Analyse quantitative
Courbe d'étalonnage
Dans les conditions expérimentales optimales, 2, 5, 8, 10, 15 et 20 μL de l'échantillon standard mixte ont été injectés et analysés, et la courbe standard est établie par volume d'injection et surface de pic.
Il est nécessaire que le coefficient de corrélation de cette courbe soit supérieur à 0,99.
Analyse des échantillons inconnus
Injecter 10 μl échantillon inconnu pour tester l'analyse quantitative par courbe d'étalonnage.
Questions
Sur la base des données expérimentales, discutez des différences de méthodes d'analyse entre la chromatographie en phase gazeuse et la chromatographie liquide.
Explorez la valeur d'application de l'analyse HPLC.
Si le détecteur UV convient pour détecter tous les composés organiques?
