Nhãn sắc học loại trừ kích thước (SEC) là một phương pháp rất hữu ích. Nó cũng được gọi là chromatography lọc gel. Nó được sử dụng để tách các phân tử dựa trên kích thước của chúng trong dung dịch. SEC khác nhau. Nó hoạt động trên cơ sở vật lý, không phải trên phản ứng hóa học như các phương pháp khác. Điều này làm cho nó trở thành một công cụ đặc biệt và an toàn cho các nhà khoa học. Bài viết này giải thích các ý tưởng cơ bản của chromatography loại trừ kích thước. Chúng ta sẽ xem tại sao một số phân tử xuất hiện trước và xem nó được sử dụng như thế nào trong khoa học. Hiểu cách SEC hoạt động có thể thực sự giúp kết quả phòng thí nghiệm của bạn, cho dù bạn là một sinh viên hoặc một chuyên gia trong công nghệ sinh học.
Nguyên tắc chromatography loại trừ kích thước
Nhãn sắc học loại trừ kích thước là một kỹ thuật phân loại các phân tử theo khối lượng thủy động lực của chúng khi chúng đi qua một giai đoạn tĩnh lỗ. Phương pháp này rất phổ biến để thanh lọc protein, nghiên cứu các polymer và nhìn vào các phân tử sinh học. Hãy’ Khám phá các ý tưởng chính giải thích cách SEC tách mọi thứ.
Cách nhiễm sắc loại trừ kích thước tách các phân tử
Trước hết, một mẫu được đặt vào một cột trong SEC. Cột này được lấp đầy với một vật liệu xốp. Đây thường là hạt nhỏ của agarose, dextran hoặc silica. Mẫu sau đó di chuyển qua cột với một chất lỏng được gọi là giai đoạn di động. Các phân tử được tách ra bởi liệu chúng có thể phù hợp với lỗ chân lông của hạt hay không. Các phân tử lớn không thể vào các lỗ chân lông nhỏ. Vì vậy, chúng di chuyển nhanh hơn giữa các hạt. Tuy nhiên, các phân tử nhỏ hơn đi một con đường dài hơn vì chúng đi vào lỗ chân lông, vì vậy chúng xuất hiện sau đó. Để chính xác hơn, SEC thực sự tách các phân tử theo khối lượng thủy lực học của chúng. Đây là lượng không gian mà một phân tử chiếm trong một dung dịch. Cả khối lượng và hình dạng đều ảnh hưởng đến khối lượng này. Ý tưởng cơ bản này giải thích tại sao các phân tử xuất hiện theo thứ tự cụ thể trong nhiễm sắc học loại trừ kích thước.
Vai trò của kích thước lỗ chân lông trong giai đoạn cố định
Kích thước lỗ chân lông của giai đoạn tĩnh là một phần rất quan trọng của SEC. Bạn cần chọn vật liệu có kích thước lỗ chân lông phù hợp cho các phân tử trong mẫu của bạn. Đây là chìa khóa. Ví dụ, một cột SEC phân tích tiêu chuẩn thường có thể tách các phân tử từ 10 kDa đến 600 kDa. Phạm vi này là tuyệt vời cho nhiều protein cầu. Bất kỳ phân tử lớn hơn 600 kDa đều bị bỏ ra hoàn toàn và xuất hiện trước tiên trong cái gọi là khối lượng rỗng (V). ₀). Mặt khác, các phân tử nhỏ hơn 10 kDa đi vào tất cả các lỗ chân lông và xuất hiện cuối cùng, gần tổng khối lượng thâm nhập (V). ₜ). Chọn kích thước lỗ chân lông đúng cho bạn sự tách biệt tốt nhất. Nó cho phép sự khác biệt rõ ràng giữa kích thước phân tử.
Sự khác biệt giữa loại trừ kích thước và các kỹ thuật nhiễm sắc khác
SEC khá khác với các phương pháp nhiễm sắc khác. Các kỹ thuật như trao đổi ion hoặc nhiễm sắc học liên quan sử dụng các tương tác hóa học, chẳng hạn như sạc hoặc ràng buộc cụ thể. Nhưng SEC chỉ tách các phân tử bằng các đặc tính thủy lực học của chúng. Không có phản ứng hóa học. Kết quả là, SEC không’ t làm hại hoặc thay đổi các phân tử sinh học tinh tế như protein. Điều gì’ Hơn nữa, các phương pháp khác như nhiễm sắc học giai đoạn ngược thường cần dung môi hữu cơ. SEC thường chỉ sử dụng bộ đệm dựa trên nước. Điều này làm cho nó phù hợp hơn nhiều với các mẫu sinh học.
Yếu tố ảnh hưởng đến trật tự lọc
Một vài thứ đóng một vai trò trong việc thiết lập thứ tự lơ tán trong nhiễm sắc học loại trừ kích thước. Bạn phải kiểm soát các yếu tố này một cách cẩn thận để có được kết quả tốt, có thể lặp lại.
Kích thước và hình dạng phân tử và tác động của chúng đến thời gian lọc
Điều chính quyết định thời gian elution trong SEC là phân tử’ Khối lượng hydrodynamic. Đó là một khái niệm đơn giản. Các phân tử lớn hơn có thể’ t đi vào lỗ chân lông của giai đoạn tĩnh. Bởi vì điều này, họ đi một chuyến đi ngắn hơn qua cột và ra trước. Các phân tử nhỏ hơn có thể đi vào lỗ chân lông. Vì vậy, họ mất nhiều thời gian hơn để vượt qua và ra ngoài sau đó. Mối quan hệ ngược lại này giữa kích thước và thời gian elution là một tính năng chính của SEC. Ngoài ra, điều rất quan trọng là biết rằng hình dạng phân tử quan trọng như khối lượng. Ví dụ, một protein dài, mỏng của 100 kDa sẽ có khối lượng thủy động lực lớn hơn so với một protein tròn có cùng khối lượng, vì vậy nó sẽ xuất hiện sớm hơn.
Vật liệu đóng gói cột và cấu trúc lỗ chân lông
Loại vật liệu được sử dụng để đóng gói cột và cấu trúc lỗ chân lông của nó có tác động lớn đến cách nó tách mọi thứ. Bạn có được kết quả tốt hơn với các vật liệu có kích thước lỗ chân lông rất nhất quán. Nếu cấu trúc lỗ chân lông không bằng nhau, các hồ sơ elution có thể lan rộng và chồng chéo. Thật xấu. Ví dụ, vật liệu dựa trên silica cứng thường được sử dụng cho các công việc hiệu suất cao với các phân tử nhỏ hơn. Ngược lại, gel dựa trên agarose liên kết chéo thường là lựa chọn tốt hơn cho các phân tử sinh học lớn hơn như protein và kháng thể.
Tốc độ dòng chảy và thành phần pha di động
Tốc độ dòng chảy của giai đoạn di động cũng ảnh hưởng đến cách các phân tử thoát ra. Tốc độ dòng chảy chậm hơn cho các phân tử nhỏ hơn nhiều thời gian để đi vào lỗ chân lông. Điều này cải thiện sự tách biệt. Nhưng nó làm cho toàn bộ quá trình mất nhiều thời gian hơn. Giai đoạn di động, thường là một bộ đệm, phải được chọn cẩn thận để ngăn chặn bất kỳ phản ứng không mong muốn nào giữa mẫu và giai đoạn tĩnh. Điều này đảm bảo rằng sự tách biệt chỉ dựa trên kích thước. Ngoài ra, đúng lượng muối (ví dụ: 150 mM NaCl) thường được thêm vào để ngăn chặn bất kỳ tương tác tĩnh điện ngẫu nhiên nào.
Hành vi lọc của các phân tử
Tại sao các phân tử lớn hơn xuất hiện trước những phân tử nhỏ hơn
Trong nhiễm sắc học loại trừ kích thước, các phân tử lớn xuất hiện trước. Điều này xảy ra bởi vì chúng được giữ ra khỏi lỗ chân lông trong giai đoạn tĩnh. Họ không thể vào trong hạt. Do đó, chúng chỉ di chuyển qua khối lượng trống, đó là không gian giữa các hạt. Đây là cách nhanh nhất để đến cuối cột. Tuy nhiên, các phân tử nhỏ hơn khác nhau. Chúng có thể đi vào lỗ chân lông. Điều này làm cho đường đi của họ dài hơn và làm tăng thời gian họ ở trong cột.
Con đường qua ma trận cột cho kích thước phân tử khác nhau
Con đường mà một phân tử đi qua cột phụ thuộc vào kích thước của nó so với kích thước lỗ chân lông.
- Các phân tử lớn (loại trừ tổng thể): Điều này hoàn toàn tránh lỗ chân lông. Chúng chỉ di chuyển qua các không gian giữa các hạt.
- Các phân tử có kích thước trung bình (bao gồm một phần): Chúng có thể đi vào một số lỗ chân lông. Điều này dẫn đến thời gian elution trung bình.
- Các phân tử nhỏ (tổng bao gồm): Chúng có thể đi vào tất cả các lỗ chân lông. Điều này dẫn đến con đường dài nhất và sự trốn thoát mới nhất.
Hạn chế trong tách dựa trên sự tương đồng phân tử
SEC là một phương pháp rất tốt. Nhưng nó gặp khó khăn trong việc tách các phân tử có cùng kích thước và hình dạng. Khi điều này xảy ra, thời gian elution của chúng có thể chồng chéo. Kết quả là sự tách biệt kém. Các nhà khoa học cần nhớ những giới hạn này khi lên kế hoạch thí nghiệm và phân tích dữ liệu của họ.
Ứng dụng của kích thước-loại trừ nhiễm sắc
Lọc và phân tích protein
Một trong những cách sử dụng thường xuyên nhất của SEC là để thanh lọc protein. Nó hoạt động rất tốt để tách các protein đơn lẻ từ các cụm hoặc các tạp chất nhỏ hơn. Nó cũng được sử dụng để nghiên cứu các nhóm protein và tìm ra trạng thái oligomeric của chúng. Điều này cung cấp thông tin quan trọng về cách chúng hoạt động trong cơ thể.
Đặc tính polymer
Trong thế giới khoa học vật liệu, SEC được sử dụng để tìm ra phân phối trọng lượng phân tử của các polymer. Ở đây, nó thường được gọi là Gel Permeation Chromatography (GPC). Thông tin này rất quan trọng để biết một polymer’ Đặc tính vật lý.
Tách phân tử sinh học trong nghiên cứu dược phẩm
Trong nghiên cứu thuốc, SEC là một công cụ quan trọng để kiểm soát chất lượng của thuốc sinh học, như kháng thể đơn clonal (mAbs), enzyme và axit nucleic. Nó có vai trò lớn trong việc tạo ra các loại thuốc mới bằng cách đo các cụm lớn và các mảnh nhỏ. Điều này đảm bảo thuốc cuối cùng là tinh khiết và ổn định.
Những cân nhắc chính cho kết quả chính xác
Điều chuẩn với tiêu chuẩn trọng lượng phân tử
Để đo kích thước tốt, trước tiên bạn phải hiệu chuẩn hệ thống. Điều này được thực hiện với các tiêu chuẩn trọng lượng phân tử. Bằng cách chạy các tiêu chuẩn được biết đến, các nhà khoa học có thể tạo ra một đường cong hiệu chuẩn. Đường cong này đồ họa khối lượng elution so với log của trọng lượng phân tử. Đối với protein, một bộ tiêu chuẩn phổ biến bao gồm Thyroglobulin (~ 670 kDa), γ-globulin (~ 158 kDa), Bovine Serum Albumin (BSA, ~ 66 kDa), Ovalbumin (~ 44 kDa) và Myoglobin (~ 17 kDa). Bước này rất quan trọng để đoán trọng lượng phân tử của các mẫu không biết.
Tầm quan trọng của việc lựa chọn và bảo trì cột
Chọn cột đúng với phạm vi kích thước lỗ chân lông đúng là rất quan trọng. Ngoài ra, bạn cần chăm sóc nó. Bảo trì thường xuyên, như làm sạch và lưu trữ nó một cách chính xác, giúp cột kéo dài hơn và hoạt động tốt mỗi lần.
Kỹ thuật chuẩn bị mẫu
Chuẩn bị mẫu cũng rất quan trọng. Các cụm hoặc mẫu bị hỏng có thể làm lộn lộn kết quả. Những thứ như lọc hoặc xoay mẫu để loại bỏ các hạt có thể giúp. Sử dụng bộ đệm giữ mẫu ổn định cũng có thể ngừng cụm. Các bước này đảm bảo rằng bạn nhận được dữ liệu tốt từ SEC.
PERSEE: Nhà sản xuất công cụ phân tích đáng tin cậy
Khi bạn cần các công cụ phân tích tốt cho nhiễm sắc học, PERSEE Một cái tên mà bạn có thể tin tưởng. Kiến thức và sản phẩm mới của họ giúp các nhà khoa học có được kết quả chính xác và lặp lại.
Tổng quan về chuyên môn của PERSEE trong các giải pháp nhiễm sắc học
PERSEE là một tên nổi tiếng cho các công cụ phân tích. Họ đã xây dựng danh tiếng là một nhà lãnh đạo trong lĩnh vực này. Họ cung cấp nhiều giải pháp khác nhau chỉ cho sử dụng chromatography. Các phòng thí nghiệm thực hiện nhiễm sắc loại trừ kích thước thường chọn chúng vì tập trung vào chất lượng và ý tưởng mới. PERSEE cung cấp cho các nhà khoa học các công cụ họ cần cho nghiên cứu tiên tiến. Sản phẩm của họ dễ sử dụng và được xây dựng để kéo dài.
Nhấn mạnh hệ thống nhiễm sắc chất lỏng hiệu suất cao L600
Các Hệ thống nhiễm sắc chất lỏng hiệu suất cao L600 là một sản phẩm hàng đầu của Persee. Nó được thực hiện để xử lý nhu cầu của ngày hôm nay’ Các phòng thí nghiệm bận rộn.
- Các tính năng hỗ trợ độ chính xác cao và khả năng tái tạo: Hệ thống L600 có các tính năng tuyệt vời. Chúng bao gồm kiểm soát dòng chảy chính xác, máy dò rất nhạy cảm và các thiết lập bạn có thể thay đổi. Điều này đảm bảo độ chính xác tuyệt vời trong công việc nhiễm sắc loại trừ kích thước. Xây dựng mạnh mẽ của nó cũng có nghĩa là ít biến thể hơn, cho bạn kết quả bạn có thể tin tưởng.
- Các ứng dụng trong các lĩnh vực công nghệ sinh học, dược phẩm và nghiên cứu học thuật: Hệ thống L600 có thể làm nhiều công việc. Nó giúp với rất nhiều nhiệm vụ khác nhau trong công nghệ sinh học, dược phẩm và nghiên cứu đại học. Nó cung cấp kết quả vững chắc cho dù bạn đang thanh lọc protein, nghiên cứu polymer hoặc phân tích các phân tử sinh học. Sự linh hoạt của nó cho thấy PERSEE quan tâm đến việc cải thiện nhiễm sắc loại trừ kích thước.
Tóm tắt của Key Insights
Trật tự khử trừ của các phân tử là đặc điểm chính của nhiễm sắc học loại trừ kích thước. Các phân tử lớn hơn thoát ra trước. Điều này là do lý do tại sao chúng bị loại trừ đi qua bên trong lỗ chân lông của giai đoạn tĩnh và có khoảng cách ngắn hơn. Các phân tử nhỏ hơn có thể thâm nhập vào lỗ chân lông. Điều này cho họ một con đường dài hơn, do đó họ trốn thoát sau đó. Giữ quy tắc dễ dàng này trong tâm trí của bạn là chìa khóa để thực hiện các thí nghiệm tốt và hiểu được dữ liệu phòng thí nghiệm của bạn.
Câu hỏi thường gặp
Q1: Điều gì làm cho SEC trở thành phương pháp ưa thích để thanh lọc protein?
A: SEC được ưa thích cho tinh khiết protein bởi vì nó tách protein theo kích thước ở trạng thái bản địa của chúng mà không sử dụng hóa chất cực đoan. Đó là một quá trình nhẹ nhàng. Điều này có nghĩa là protein hoạt động và có chức năng. Ngoài ra, SEC thực hiện đặc biệt tốt trong việc loại bỏ các tập hợp protein, điều này có tầm quan trọng cao đối với chất lượng của thuốc protein.
Q2: Làm thế nào tôi có thể cải thiện độ phân giải trong các thí nghiệm SEC?
A: Để có được sự tách biệt tốt hơn, bạn có thể làm một số điều:
- Sử dụng một cột với hạt nhỏ hơn và kích thước lỗ chân lông tốt cho mẫu của bạn.
- Sử dụng một cột dài hơn, cho các phân tử nhiều không gian để di chuyển.
- Giảm tỷ lệ dòng chảy. Điều này cho các phân tử nhiều thời gian hơn để dành cho giai đoạn tĩnh.
Q3: Nhãn sắc học loại trừ kích thước có phù hợp với tất cả các loại phân tử không?
A: SEC rất có giá trị, nhưng nó’ tốt nhất khi các phân tử có kích thước khác nhau. Nó có thể thấy khó để tách các phân tử với khối lượng thủy động lực rất tương tự. Nếu bạn’ re có vấn đề này, bạn có thể thử sử dụng SEC kết hợp với các phương pháp khác (như nhiễm sắc trao đổi ion) để có được sự tách bạn cần.
