ข่าว

โครมาโตกราฟียกเว้นขนาด (SEC) เป็นวิธีที่มีประโยชน์มาก มันยังเรียกว่า chromatography การกรองเจล มันใช้ในการแยกโมเลกุลตามขนาดของพวกเขาในสารละลาย SEC แตกต่างกัน มันทำงานบนพื้นฐานทางกายภาพ ไม่ใช่บนปฏิกิริยาทางเคมี เช่นวิธีอื่น ๆ นี่ทำให้มันเป็นเครื่องมือพิเศษและปลอดภัยสําหรับนักวิทยาศาสตร์ บทความนี้อธิบายความคิดพื้นฐานของ chromatography ยกเว้นขนาด เราจะดูว่าทำไมโมเลกุลบางอย่างออกมาก่อน และดูว่ามันใช้ในวิทยาศาสตร์อย่างไร การเข้าใจว่า SEC ทํางานอย่างไร สามารถช่วยให้ผลการทดลองของคุณได้ ไม่ว่าคุณจะเป็นนักเรียนหรือผู้เชี่ยวชาญด้านชีวเทคโนโลยี

หลักการของ Chromatography การยกเว้นขนาด

โครมาโตกราฟียกเว้นขนาด เป็นเทคนิคที่จัดเรียงโมเลกุลตามปริมาณไฮโดรไดนามิกของพวกเขา เมื่อพวกเขาผ่านช่วงคงที่รูพรุน วิธีนี้เป็นเรื่องทั่วไปมากในการทำความสะอาดโปรตีน การศึกษาโพลีเมอร์ และดูโมเลกุลชีวภาพ ให้’ สำรวจความคิดหลักที่อธิบายว่า SEC แยกสิ่งต่างๆ อย่างไร

วิธีการแยกโมเลกุลโดยการยกเว้นขนาด Chromatography

ก่อนอื่น ตัวอย่างถูกใส่ลงในคอลัมน์ใน SEC คอลัมน์นี้เต็มไปด้วยวัสดุรูพรุน เหล่านี้มักจะเป็นลูกปัดขนาดเล็ก ๆ ของ agarose, dextran, หรือซิลิกา. ตัวอย่างจากนั้นเคลื่อนไหวผ่านคอลัมน์ด้วยของเหลวที่เรียกว่าเฟสเคลื่อนไหว โมเลกุลถูกแยกออกจากมันสามารถเข้าไปในรูขุมขุมของลูกปัดได้หรือไม่ โมเลกุลใหญ่ไม่สามารถเข้าไปในรูขุมขุมขุมขนาดเล็กได้ ดังนั้น พวกมันเคลื่อนที่เร็วขึ้นระหว่างลูกปัด แต่โมเลกุลขนาดเล็ก ๆ จะใช้เส้นทางที่ยาวนาน เพราะพวกเขาเข้าไปในรูขุมขุม ดังนั้นจึงออกมาในภายหลัง เพื่อที่จะแม่นยำกว่า SEC แยกโมเลกุลโดยปริมาณไฮโดรไดนามิกของพวกเขา นี่คือปริมาณพื้นที่ที่โมเลกุลใช้ในสารละลาย ทั้งมวลและรูปร่างมีผลต่อปริมาณนี้ ความคิดพื้นฐานนี้อธิบายว่าทำไมโมเลกุลออกมาในลำดับเฉพาะในโครมาโตกราฟย์ยกเว้นขนาด

บทบาทของขนาดรูขุมขุมขุมในระยะคงที่

ขนาดรูขุมขุมขุมของระยะคงที่เป็นส่วนสำคัญมากของ SEC คุณต้องเลือกวัสดุที่มีขนาดรูขุมขุมขุมที่เหมาะสมสําหรับโมเลกุลในตัวอย่างของคุณ นี่คือกุญแจ ตัวอย่างเช่น คอลัมน์ SEC การวิเคราะห์มาตรฐานมักจะแยกโมเลกุลจาก 10 kDa ถึง 600 kDa ช่วงนี้เหมาะสำหรับโปรตีนลูกหลายชนิด โมเลกุลใด ๆ ที่ใหญ่กว่า 600 kDa จะถูกทิ้งออกอย่างสมบูรณ์และออกมาแรกในสิ่งที่เรียกว่าปริมาณว่างเปล่า (V ₀). ในทางกลับกัน โมเลกุลขนาดเล็กกว่า 10 kDa เข้าไปในรูขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุ ₜ). การเลือกขนาดรูขุมขุมขุมที่ถูกต้องจะให้คุณมีการแยกที่ดีที่สุด มันทำให้มีความแตกต่างที่ชัดเจนระหว่างขนาดโมเลกุล

ความแตกต่างระหว่างการยกเว้นขนาดและเทคนิคอื่น ๆ

SEC แตกต่างจากวิธีการ chromatography อื่น ๆ เทคนิคเช่น การแลกเปลี่ยนไอออน หรือ โครมาโตกราฟีความเชื่อมโยง ใช้ปฏิสัมพันธ์ทางเคมี เช่น การชาร์จหรือการผูกพันเฉพาะ แต่ SEC แยกโมเลกุลเพียงด้วยคุณสมบัติไฮโดรไดนามิกของมันเท่านั้น ไม่มีปฏิกิริยาเคมี ดังนั้น SEC ไม่’ t ทำให้เกิดอันตรายหรือเปลี่ยนโมเลกุลชีวภาพที่ละเอียดอ่อนเช่นโปรตีน อะไร’ วิธีอื่น ๆ เช่น chromatography เฟสย้อนกลับมักจะต้องใช้ตัวทำละลายอินทรีย์ SEC มักจะใช้แค่บัฟเฟอร์ที่ใช้น้ำ นี่ทำให้มันเหมาะกับตัวอย่างทางชีวภาพมากขึ้น

ปัจจัยที่มีอิทธิพลต่อคำสั่ง Elution

บางสิ่งที่มีส่วนร่วมในการตั้งลำดับการลดลงในโครมาโตกราฟย์ยกเว้นขนาด คุณต้องควบคุมปัจจัยเหล่านี้อย่างระมัดระวัง เพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ดี และซ้ำได้

ขนาดและรูปร่างโมเลกุลและผลกระทบที่มีต่อเวลาการละลาย

สิ่งที่สำคัญที่ตัดสินใจเวลา elution ใน SEC คือโมเลกุล’ s ปริมาณไฮโดรไดนามิก มันเป็นแนวคิดที่เรียบง่าย โมเลกุลขนาดใหญ่สามารถ’ t เข้าไปในรูขุมขุมของระยะคงที่ เพราะนี้พวกเขาเดินทางสั้นกว่าผ่านคอลัมน์ และออกมาก่อน โมเลกุลขนาดเล็กสามารถเข้าไปในรูขุมขุม ดังนั้น พวกเขาใช้เวลานานเพื่อผ่านและออกมาในภายหลัง ความสัมพันธ์ตรงกันข้ามระหว่างขนาดและเวลา elution เป็นคุณสมบัติสำคัญของ SEC นอกจากนี้ยังมีความสำคัญมากที่จะรู้ว่ารูปร่างโมเลกุลมีความสำคัญมากเท่ากับมวล ตัวอย่างเช่นโปรตีนยาวบางของ 100 kDa จะมีปริมาณไฮ

วัสดุบรรจุคอลัมน์และโครงสร้างรูขุมขุม

ประเภทของวัสดุที่ใช้ในการบรรจุคอลัมน์และโครงสร้างรูขุมขุมขุมของมันมีผลกระทบมากต่อการแยกสิ่งอย่างดีแค่ไหน คุณจะได้ผลลัพธ์ที่ดีขึ้นด้วยวัสดุที่มีขนาดรูขุมขุมขุมที่สม่ำเสมอมาก ถ้าโครงสร้างรูขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุม นั่นแย่เลย ตัวอย่างเช่นวัสดุที่ใช้ซิลิกาแข็งมักจะใช้สําหรับงานที่มีประสิทธิภาพสูงที่มีโมเลกุลขนาดเล็ก ในทางกลับกันแล้ว เจลที่ใช้อากาโรสที่เชื่อมโยงข้ามกันมักจะเป็นตัวเลือกที่ดีกว่าสําหรับโมเลกุลชีวภาพที่ใหญ่กว่า เช่น โปรตีนแล

อัตราการไหลและองค์ประกอบเฟสมือถือ

อัตราการไหลของเฟสเคลื่อนที่ยังมีผลต่อวิธีการปล่อยโมเลกุล อัตราการไหลที่ช้าลง ทําให้โมเลกุลขนาดเล็ก ๆ มีเวลามากขึ้นในการเข้าไปในรูขุมขุม นี่จะปรับปรุงการแยก แต่มันทำให้กระบวนการทั้งหมดใช้เวลานาน เฟสเคลื่อนย้าย โดยปกติคือบัฟเฟอร์ ต้องเลือกอย่างรอบคอบเพื่อหยุดปฏิกิริยาที่ไม่ต้องการใด ๆ ระหว่างตัวอย่างและเฟสคงที่ นี่จะรับประกันว่าการแยกขึ้นอยู่กับขนาดเท่านั้น นอกจากนี้ ปริมาณเกลือที่เหมาะสม (เช่น 150 mM NaCl) มักจะถูกเพิ่มเพื่อหยุดการปฏิสัมพันธ์ไฟฟ้าสถิตแบบสุ่ม

พฤติกรรมการล้างของโมเลกุล

ทำไมโมเลกุลขนาดใหญ่เกิดขึ้นก่อนโมเลกุลขนาดเล็ก

ในโครมาโตกราฟย์ยกเว้นขนาด โมเลกุลใหญ่ออกมาแรก นี่เกิดขึ้นเพราะมันถูกเก็บไว้ออกจากรูขุมขุมขุมในระยะที่คงที่ พวกเขาเข้าไปในลูกปัดไม่ได้ ดังนั้น พวกมันเคลื่อนที่ผ่านปริมาณว่างเปล่า ซึ่งเป็นพื้นที่ระหว่างลูกปัด นี่คือวิธีที่เร็วที่สุดไปยังปลายคอลัมน์ แต่โมเลกุลที่เล็ก ๆ ก็แตกต่างกัน มันสามารถเข้าไปในรูขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมข นี่ทำให้เส้นทางของพวกเขายาวนาน และเพิ่มเวลาที่พวกเขาอยู่ในคอลัมน์

เส้นทางผ่านเมทริกซ์คอลัมน์สำหรับขนาดโมเลกุลที่แตกต่างกัน

เส้นทางที่โมเลกุลตามผ่านคอลัมน์ขึ้นอยู่กับขนาดของมันเมื่อเทียบกับขนาดรูขุมขุม

• โมเลกุลขนาดใหญ่ (ยกเว้นทั้งหมด): เหล่านี้หลีกเลี่ยงรูพรุนอย่างสมบูรณ์ พวกเขาเคลื่อนไหวผ่านช่องว่างระหว่างลูกปัด
• โมเลกุลขนาดกลาง (รวมบางส่วน): พวกนี้สามารถเข้าไปในรูขุมขุมขุมบางอย่าง นี่นําไปสู่เวลาการกําลังกระจายกลาง
• โมเลกุลเล็ก (รวมทั้งหมด): พวกนี้สามารถเข้าไปในพื้นที่รูขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมขุมข นี่ส่งผลให้มีเส้นทางที่ยาวที่สุดและการหลุดล่าสุด

ข้อจํากัดในการแยกตามความคล้ายคลึงกันโมเลกุล

SEC เป็นวิธีที่ดีมาก แต่มันมีปัญหาในการแยกโมเลกุลที่มีขนาดและรูปร่างเดียวกัน เมื่อเกิดขึ้นเรื่องนี้ เวลาการลดลงของพวกเขาอาจซ้อนกันได้ ผลลัพธ์คือการแยกที่ไม่ดี นักวิทยาศาสตร์ต้องจําขอบเขตเหล่านี้ เมื่อพวกเขาวางแผนการทดลอง และวิเคราะห์ข้อมูลของพวกเขา

การใช้งานของ Chromatography ยกเว้นขนาด

การฟอกและวิเคราะห์โปรตีน

หนึ่งในการใช้บ่อยที่สุดของ SEC คือการทำความสะอาดโปรตีน มันทำงานได้ดีมากในการแยกโปรตีนเดียวจากกลุ่มหรือสิ่งสกปรกขนาดเล็ก มันยังใช้ในการศึกษากลุ่มโปรตีน และค้นหาสถานะโอลิโกอเมริกของพวกเขา นี่ให้ข้อมูลสําคัญเกี่ยวกับวิธีการทํางานของพวกเขาในร่างกาย

การจำแนกลักษณะของพอลิเมอร์

ในโลกของวิทยาศาสตร์วัสดุ SEC ถูกใช้ในการค้นหาการกระจายน้ำหนักโมเลกุลของโพลิเมอร์ ที่นี่มักจะเรียกว่า Gel Permeation Chromatography (GPC) ข้อมูลนี้เป็นสิ่งสำคัญมากสำหรับการรู้โพลิเมอร์’ คุณสมบัติทางกายภาพ

การแยกโมเลกุลชีวภาพในการวิจัยยา

ในการวิจัยยา SEC เป็นเครื่องมือสำคัญสําหรับการควบคุมคุณภาพของยาทางชีวภาพ เช่น แอนติบอดี้โมโนโคลอน (mAbs) เอนไซม์ และกรดนิวเคลีย มันมีบทบาทใหญ่ในการสร้างยาใหม่ โดยการวัดกลุ่มใหญ่และชิ้นเล็ก นี่จะทำให้ยาสุดท้ายบริสุทธิ์และมั่นคง

ข้อควรพิจารณาสำคัญสําหรับผลที่ถูกต้อง

การปรับเทียบด้วยมาตรฐานน้ำหนักโมเลกุล

สําหรับการวัดขนาดที่ดี คุณต้องปรับระบบก่อน นี่ทำด้วยมาตรฐานน้ำหนักโมเลกุล โดยใช้มาตรฐานที่รู้จัก นักวิทยาศาสตร์สามารถสร้างเส้นโค้งการปรับเทียบ เส้นโค้งนี้วาดปริมาณการอีลูชั่นเทียบกับล็อกของน้ำหนักโมเลกุล สำหรับโปรตีนชุดมาตรฐานทั่วไปรวมถึง Thyroglobulin (~ 670 kDa), γ-globulin (~ 158 kDa), Bovine Serum Albumin (BSA, ~ 66 kDa), Ovalbumin (~ 44 kDa) และ Myoglobin (~ 17 kDa) ขั้นตอนนี้เป็นสิ่งสำคัญในการเดาน้ำหนักโมเลกุลของตัวอย่างที่ไม่รู้จัก

ความสำคัญของการเลือกและบำรุงรักษาคอลัมน์

การเลือกคอลัมน์ขวาที่มีขนาดรูขุมขุมขวาเป็นสิ่งสำคัญ นอกจากนี้ คุณต้องดูแลมัน การบำรุงรักษาเป็นประจํา เช่น การทำความสะอาดและเก็บมันอย่างถูกต้อง ช่วยให้คอลัมน์มีอายุนานและทํางานได้ดี

เทคนิคการเตรียมตัวอย่าง

การเตรียมตัวอย่างยังเป็นสิ่งสำคัญมาก กลุ่มหรือตัวอย่างที่แตกลง อาจทำให้ผลลัพธ์ที่ได้รับผิดพลาด สิ่งเช่นการกรอง หรือการหมุนตัวอย่าง เพื่อกำจัดอนุภาคสามารถช่วยได้ การใช้บัฟเฟอร์ที่ทําให้ตัวอย่างมั่นคงยังสามารถหยุดการกลุ่มได้ ขั้นตอนเหล่านี้ให้แน่ใจว่าคุณได้รับข้อมูลที่ดีจาก SEC

PERSEE: ผู้ผลิตเครื่องมือวิเคราะห์ที่เชื่อถือได้

เมื่อคุณต้องการเครื่องมือวิเคราะห์ที่ดีสําหรับโครมาโตกราฟี เพอร์ส เป็นชื่อที่คุณไว้วางใจได้ ความรู้และผลิตภัณฑ์ใหม่ของพวกเขาช่วยให้นักวิทยาศาสตร์ได้รับผลที่แม่นยำและซ้ำได้

ภาพรวมความเชี่ยวชาญของ PERSEE ในโซลูชั่นโครมาโตกราฟี

PERSEE เป็นชื่อที่รู้จักกันดีสําหรับเครื่องมือวิเคราะห์ พวกเขาได้สร้างชื่อเสียงเป็นผู้นําในพื้นที่นี้ พวกเขา ให้บริการโซลูชั่นที่แตกต่างกันมากมาย เพียงสำหรับการใช้โครมาโตกราฟี ห้องปฏิบัติการที่ทำโครมาโตกราฟย์ยกเว้นขนาดมักจะเลือกพวกเขาเพราะมุ่งเน้นคุณภาพและความคิดใหม่ PERSEE ให้นักวิทยาศาสตร์เครื่องมือที่พวกเขาต้องการสําหรับการวิจัยที่ก้าวหน้า ผลิตภัณฑ์ของพวกเขาใช้งานง่าย และสร้างขึ้นเพื่อให้ยาวนาน

เน้นระบบโครมาโตกราฟของเหลวที่มีประสิทธิภาพสูง L600

ที่ ระบบโครมาโตกราฟของเหลวที่มีประสิทธิภาพสูง L600 เป็นผลิตภัณฑ์ยอดนิยมจาก PERSEE มันทำให้จัดการกับความต้องการของวันนี้’ ห้องทดลองที่ยุ่ง

1. คุณสมบัติที่รองรับความแม่นยำสูงและความสามารถในการทำซ้ำ: ระบบ L600 มีคุณสมบัติที่ดี เหล่านี้รวมถึงการควบคุมการไหลที่แม่นยำ เครื่องตรวจจับที่มีความไวมาก และการตั้งค่าที่คุณสามารถเปลี่ยนแปลงได้ นี้รับประกันความแม่นยำที่น่าตื่นตาตื่นใจในการทำงาน chromatography ยกเว้นขนาด การสร้างที่แข็งแกร่งของมันยังหมายถึงความแตกต่างที่น้อยกว่า ซึ่งให้คุณ
2. การใช้งานทั่วชีวเทคโนโลยี, ยา, และสาขาวิจัยทางวิชาการ: ระบบ L600 สามารถทำงานได้มากมาย มันช่วยในการทำงานที่แตกต่างกันมากมาย ในด้านเทคโนโลยีชีวภาพ ยา และการวิจัยมหาวิทยาลัย มันจะให้ผลลัพธ์ที่แข็งแกร่ง ไม่ว่าคุณจะทำความสะอาดโปรตีน การศึกษาโพลีเมอร์ หรือการวิเคราะห์โมเลกุลชีวภาพ ความยืดหยุ่นของมันแสดงให้เห็นว่า PERSEE สนใจมากแค่ไหนเกี่ยวกับการปรับปรุง chromatography การยกเว้นขนาด

สรุปข้อมูลที่สำคัญ

ลำดับการ elution ของโมเลกุลเป็นคุณสมบัติหลักของขนาด-ยกเว้น chromatography. โมเลกุลที่ใหญ่กว่าจะออกก่อน นี่เป็นเหตุผลที่พวกเขาถูกยกเว้นจากการผ่านภายในรูขุมขุมของระยะที่คงที่ และมีระยะทางสั้นกว่า โมเลกุลขนาดเล็กสามารถเจาะรูขุมขุมขุม นี่ทำให้พวกเขามีเส้นทางที่ยาวนาน ดังนั้นพวกเขาจึงหนีไปในภายหลัง การรักษากฎง่ายนี้ในใจของคุณ เป็นกุญแจในการทําการทดลองที่ดี และทําให้ข้อมูลห้องทดลองของคุณมีความหมาย

คำถามที่พบบ่อย

Q1: อะไรทําให้ SEC เป็นวิธีการที่ดีที่สุดสําหรับการฟอกโปรตีน?

ตอบ: SEC เป็นที่นิยมสําหรับการทำความสะอาดโปรตีนเพราะมันแยกโปรตีนตามขนาดในรัฐพื้นฐานของพวกเขาโดยไม่ใช้สารเคมีที่รุนแรง มันเป็นกระบวนการที่อ่อนโยน นี่หมายความว่าโปรตีนมีการทํางานและทํางาน นอกจากนี้ SEC มีประสิทธิภาพดีอย่างพิเศษในการกําจัดการรวมโปรตีน ซึ่งมีความสำคัญมากต่อคุณภาพของยาโปรตีน

Q2: ฉันจะปรับปรุงความละเอียดในการทดลอง SEC ได้อย่างไร?

ตอบ: เพื่อให้การแยกที่ดีขึ้นคุณสามารถทำหลายสิ่ง:

• ใช้คอลัมน์ที่มีลูกปัดขนาดเล็ก ๆ และขนาดรูขุมขุมขุมที่ดีสําหรับตัวอย่างของคุณ
• ใช้คอลัมน์ที่ยาว ซึ่งให้โมเลกุลมีพื้นที่มากขึ้นในการเคลื่อนย้าย
• ลดอัตราการไหล นี่ให้โมเลกุลมีเวลามากขึ้นในการใช้เวลากับช่วงคงที่

Q3: โครมาโตกราฟยกเว้นขนาดเหมาะสำหรับโมเลกุลทุกชนิดหรือไม่?

ตอบ: SEC มีค่ามาก แต่มัน’ ที่ดีที่สุดเมื่อโมเลกุลมีขนาดที่แตกต่างกัน มันอาจยากที่จะแยกโมเลกุลที่มีปริมาณไฮโดรไดนามิคที่คล้ายกันมาก ถ้าคุณ’ คุณสามารถลองใช้ SEC ร่วมกับวิธีอื่น ๆ (เช่น chromatography การแลกเปลี่ยนไอออน) เพื่อให้ได้การแยกที่คุณต้องการ