Хроматография исключения размера (SEC) является очень полезным методом. Также известна как гелевая фильтрационная хроматография. Используется для разделения молекул на основе их размера в растворе. SEC отличается. Он действует на физической основе, а не на химических реакциях, как и другие методы. Это делает его особым и безопасным инструментом для ученых. В этой статье объясняются основные идеи хроматографии исключения размера. Мы посмотрим, почему некоторые молекулы появляются в первую очередь, и посмотрим, как они используются в науке. Понимание того, как работает SEC, действительно может помочь вашим лабораторным результатам, независимо от того, являетесь ли вы студентом или профессионалом в области биотехнологий.
Принципы исключительной хроматографии
Хроматография исключения размера - это метод, который сортирует молекулы по их гидродинамическому объему, когда они проходят через пористую стационарную фазу. Этот метод очень распространен для очистки белков, изучения полимеров и изучения биомолекул. Давайте’ Исследуйте основные идеи, которые объясняют, как SEC разделяет вещи.
Как размерная хроматография отделяет молекулы
Прежде всего образец помещают в колонку в SEC. Эту колонку заполняют пористым материалом. Это часто крошечные бисеры агарозы, декстрана или кремниевого диоксида. Затем образец перемещается через колонну с жидкостью, называемой мобильной фазой. Молекулы отделяются тем, могут ли они вписаться в поры бисера. Большие молекулы не могут попасть в маленькие поры. Таким образом, они движутся быстрее между бусинами. Однако мелкие молекулы проходят более длительный путь, потому что они входят в поры, поэтому они выходят позже. Более точно, SEC действительно отделяет молекулы по их гидродинамическому объему. Это количество пространства, которое молекула занимает в растворе. И масса, и форма влияют на этот объем. Эта основная идея объясняет, почему молекулы выходят в определенном порядке в хроматографии с исключением размера.
Роль размера пор в стационарной фазе
Размер пор стационарной фазы является очень важной частью SEC. Вам нужно выбрать материалы с правильными размерами пор для молекул в вашем образце. Это ключ. Например, стандартная аналитическая колонна SEC часто может отделять молекулы от 10 кДа до 600 кДа. Этот диапазон отлично подходит для многих шаровых белков. Любые молекулы больше 600 кDa полностью исключаются и выходят сначала в том, что называется пустым объемом (V). ₀). С другой стороны, молекулы меньше 10 кDa входят во все поры и выходят последними, близки к общему объему проникновения (V). ₜ). Выбор правильного размера пор дает вам лучшее разделение. Это позволяет четко различать молекулярные размеры.
Различия между исключением размера и другими хроматографическими методами
SEC отличается от других методов хроматографии. Такие методы, как ионный обмен или аффинитетная хроматография, используют химические взаимодействия, такие как заряд или специфическое связывание. Но SEC отделяет молекулы только их гидродинамическими свойствами. Нет химических реакций. В результате SEC не’ t повредить или изменить деликатные биомолекулы, такие как белки. Что’ Более того, другие методы, такие как обратная фазная хроматография, часто нуждаются в органических растворителях. SEC обычно использует только буферы на водной основе. Это делает его гораздо более подходящим для биологических образцов.
Факторы, влияющие на порядок элюции
Несколько вещей играют роль в установлении порядка элюции в хроматографии исключения размера. Вы должны контролировать эти факторы осторожно, чтобы получить хорошие, повторяемые результаты.
Размер и форма молекул и их влияние на время элюции
Главное, что определяет время элюции в SEC, это молекула’ гидродинамический объем. Это простая концепция. Большие молекулы могут’ t попадает в поры стационарной фазы. Из-за этого они совершают короткую поездку по колонне и выходят первыми. Маленькие молекулы могут попасть в поры. Поэтому им требуется больше времени, чтобы пройти и выйти позже. Эта противоположная связь между размером и временем элюции является ключевой особенностью SEC. Кроме того, очень важно знать, что молекулярная форма имеет значение столько же, сколько и масса. Например, длинный, тонкий белок 100 кDa будет иметь больше гидродинамического объема, чем круглый белок с той же массой, поэтому он появится раньше.
Материал упаковки колонки и структура пор
Тип материала, используемого для упаковки колонны, и ее порная структура оказывают большое влияние на то, насколько хорошо она разделяет вещи. Вы получаете лучшие результаты с материалами, которые имеют очень последовательные размеры пор. Если структура пор не равномерна, профили элюции могут распространяться и перекрываться. Это плохо. Например, жесткие материалы на основе кремния часто используются для высокопроизводительных работ с меньшими молекулами. Напротив, крестовые гели на основе агарозы обычно являются лучшим выбором для более крупных биомолекул, таких как белки и антитела.
Скорость потока и композиция мобильной фазы
Скорость потока мобильной фазы также влияет на то, как молекулы элюируют. Более медленная скорость потока дает меньшим молекулам больше времени для проникновения в поры. Это улучшает разделение. Но это заставляет весь процесс занять больше времени. Мобильную фазу, обычно буфер, следует тщательно выбирать, чтобы остановить любые нежелательные реакции между образцом и стационарной фазой. Это гарантирует, что разделение основано только на размере. Кроме того, правильное количество соли (например, 150 мМ NaCl) часто добавляется, чтобы остановить любые случайные электростатические взаимодействия.
Элюционное поведение молекул
Почему большие молекулы появляются раньше малых
В хроматографии с исключением размера крупные молекулы выходят первыми. Это происходит потому, что они держатся вне пор в стационарной фазе. Они не могут попасть внутрь бусинов. Таким образом, они перемещаются только через пустый объем, который является пространством между бисерами. Это самый быстрый путь к концу колонки. Однако мелкие молекулы отличаются. Они могут попасть в поры. Это делает их путь длинным и увеличивает время их пребывания в колонне.
Пути через колонную матрицу для различных размеров молекул
Путь молекулы через колонну зависит от ее размера по сравнению с размером пор.
- Большие молекулы (полное исключение): Они полностью избегают пор. Они перемещаются только через пространства между бусинами.
- Средние молекулы (частичное включение): Они могут попасть в некоторые поры. Это приводит к среднему времени элюции.
- Малые молекулы (общее включение): Они могут попасть во все порное пространство. Это приводит к самому длинному пути и последней элюции.
Ограничения разделения на основе молекулярного сходства
SEC – очень хороший метод. Но у него есть проблемы с разделением молекул, которые примерно одинаковы в размере и форме. Когда это происходит, их время элюции может перекрываться. Результатом является плохое разделение. Ученые должны помнить эти границы, когда планируют свои эксперименты и анализируют свои данные.
Применение хроматографии исключения размера
Очистка и анализ белков
Одним из наиболее часто используемых методов СЭК является очистка белка. Он очень хорошо работает для отделения отдельных белков от скоплений или меньших примесей. Он также используется для изучения белковых групп и выявления их олигомерных состояний. Это дает важную информацию о том, как они работают в организме.
Характеристика полимера
В мире материаловедения SEC используется для определения распределения молекулярного веса полимеров. Здесь его часто называют гелевой пермеационной хроматографией (GPC). Эта информация очень важна для познания полимера’ с физическими свойствами.
Разделение биомолекул в фармацевтических исследованиях
В исследованиях лекарственных препаратов SEC является ключевым инструментом для контроля качества биологических препаратов, таких как моноклональные антитела (mAbs), ферменты и нуклеиновые кислоты. Он играет большую роль в создании новых лекарств, измеряя большие скопления и небольшие куски. Это гарантирует, что окончательное лекарство чистое и стабильное.
Ключевые соображения для точных результатов
Калибровка по стандартам молекулярного веса
Для хорошего измерения размера сначала необходимо калибрировать систему. Это делается по стандартам молекулярного веса. Используя известные стандарты, ученые могут сделать кривую калибровки. Эта кривая отображает объем элюции против лога молекулярного веса. Для белков общий набор стандартов включает тироглобулин (~670 кDa), γ-глобулин (~158 кDa), албумин сыворотки говядины (BSA, ~66 кDa), овалбумин (~44 кDa) и миоглобин (~17 кDa). Этот шаг имеет жизненно важное значение для угадания молекулярного веса неизвестных образцов.
Важность выбора и обслуживания колонки
Выбор правильной колонки с правильным диапазоном размеров пор имеет решающее значение. Кроме того, вам нужно позаботиться об этом. Регулярное обслуживание, такое как правильная чистка и хранение, помогает колонке длиться дольше и каждый раз хорошо работать.
Методы подготовки образцов
Подготовка образца также очень важна. Группы или разбитые образцы могут испортить результаты. Такие вещи, как фильтрация или вращение образца, чтобы избавиться от частиц, могут помочь. Использование буферов, которые поддерживают стабильность образца, также может остановить скопление. Эти шаги гарантируют, что вы получаете хорошие данные от SEC.
PERSEE: надежный производитель аналитических приборов
Когда вам нужны хорошие аналитические инструменты для хроматографии, Перси Имя, которому можно доверять. Их знания и новые продукты помогают ученым получить точные и повторимые результаты.
Обзор экспертизы PERSEE в области хроматографических решений
PERSEE – хорошо известное название для аналитических инструментов. Они создали репутацию лидера в этой области. Они предлагает множество различных решений Только для использования в хроматографии. Лаборатории, которые делают хроматографию исключения размера, часто выбирают их из-за их внимания к качеству и новым идеям. PERSEE предоставляет ученым инструменты, необходимые для передовых исследований. Их продукция проста в использовании и построена для долговечности.
Высокопродуктивная система жидкостного хроматографа L600
В Система высокопроизводительного жидкого хроматографа L600 Это лучший продукт от PERSEE. Он сделан для удовлетворения потребностей сегодняшнего дня’ Занятые лаборатории.
- Особенности, поддерживающие высокую точность и воспроизводительность: Система L600 обладает отличными особенностями. К ним относятся точный контроль потока, очень чувствительные детекторы и настройки, которые вы можете изменить. Это обеспечивает удивительную точность в работе хроматографии с исключением размера. Его сильная конструкция также означает меньше вариаций, дающих вам результаты, на которые вы можете рассчитывать.
- Применения в биотехнологических, фармацевтических и академических областях исследований: Система L600 может выполнять много работ. Он помогает с множеством различных задач в области биотехнологий, фармацевтики и университетских исследований. Он дает твердые результаты, будь то очистка белков, изучение полимеров или анализ биомолекул. Его гибкость показывает, насколько PERSEE заботится о улучшении хроматографии исключения размера.
Резюме ключевых представлений
Порядок элюции молекул является основной особенностью хроматографии по исключению размера. Большие молекулы выделяются сначала. Это связано с тем, что они исключены из прохождения внутри пор стационарной фазы и имеют более короткое расстояние. Маленькие молекулы могут проникать в поры. Это дает им более длительный путь, поэтому они уходят позже. Сохранение этого простого правила в вашем уме является ключом к проведению хороших экспериментов и пониманию ваших лабораторных данных.
Часто задаваемые вопросы
Q1: Что делает SEC предпочтительным методом для очистки белка?
Ответ: SEC предпочтительнее для очистки белков, потому что он отделяет белки в соответствии с размером в их родном состоянии без использования экстремальных химических веществ. Это нежный процесс. Это означает, что белки являются активными и функциональными. Кроме того, SEC отлично справляется с удалением белковых агломератов, что имеет очень важное значение для качества белковых препаратов.
Q2: Как я могу улучшить разрешение в экспериментах SEC?
А: Чтобы получить лучшее разделение, вы можете сделать ряд вещей:
- Используйте колонку с меньшими бисерами и хорошим размером пор для вашего образца.
- Используйте длинную колонку, которая дает молекулам больше места для перемещения.
- Снизить скорость потока. Это дает молекулам больше времени на стационарную фазу.
Вопрос 3: Подходит ли хроматография с исключением размера для всех типов молекул?
A: SEC очень ценна, но это’ Лучше всего, когда молекулы разных размеров. Ему может быть трудно отделить молекулы с очень похожими гидродинамическими объемами. Если вы’ Если у вас есть эта проблема, вы можете попробовать использовать SEC в сочетании с другими методами (такими как ионообменная хроматография), чтобы получить необходимое разделение.
