Applicazioni

Obiettivi sperimenta
Per esperimenti, impara i principi di base dell'analisi cromatografica e il funzionamento di base dello strumento e comprendi il processo di analisi dei dati.
Scopri i metodi quantitativi cromatografici e confronta i vantaggi e gli svantaggi di diversi metodi.

Introduzione HPLC
Alta velocità: HPLC utilizza apparecchiature di infusione ad alta pressione, la portata è notevolmente aumentata e la velocità di analisi è estremamente veloce, solo pochi minuti in generale;
Efficiente: le particelle di riempimento sono molto fini e regolari, il rivestimento sulla fase stazionaria è uniforme e la resistenza al trasferimento di massa è piccola, quindi l'efficienza della colonna è molto elevata.
Elevata sensibilità: il rivelatore è estremamente sensibile: UV- 10-9g, rilevatore di fluorescenza- 10- 11g.

Confronto HPLC con GC

Oggetto e ambito di analisi: l'analisi GC è limitata ai gas e ai composti stabili a basso consumo, che rappresentano solo il 20% della materia organica totale;

La scelta della fase mobile: GC utilizza tipi opzionali limitati di gas "inerte" come fase mobile, portano solo un piccolo effetto sui componenti.

Temperatura operativa: GC richiede temperature elevate;
Campi di applicazione
A causa della sua elevata sensibilità, accuratezza quantitativa e adatta all'analisi di componenti non volatili e termicamente instabili, l'analisi di separazione HPLC è estremamente versatile nella ricerca industriale e scientifica, specialmente in biologia e medicina.

Struttura e principio HPLC

Fig. 1 Struttura HPLC

HPLC è costituito dal sistema di pompe, sistema di iniezione, sistema di separazione, rivelatore e sistema di elaborazione dei dati.

Sistema di infusione ad alta pressione
1) Bottiglia di fase mobile: bottiglia di vetro da 1-2L con filtro solvente (lega NI), i suoi pori sono di circa 2 μm, impedendo il pompaggio delle particelle.
2) Degasser: degasaggio ad ultrasuoni degassanti o riscaldamento sotto vuoto.

3) Pompa ad alta pressione: i requisiti per la pompa di infusione: buona tenuta, flusso stabile senza afflusso, ampio intervallo regolabile e resistenza alla corrosione.

Sistema di iniezione

Iniettore manuale o autocampionatore

Fig.2 Principio di iniezione

Sistema di separazione delle colonne

Fig.2 Principio di separazione

Fig.3 UVD

Principio di separazione
Processo cromatografico: nei sistemi con due fasi impossibili, la fase mobile e la fase stazionaria, il terzo componente (cioè il soluto o l'adsorbato) è una distribuzione continuamente alternante tra le due fasi.
A causa delle differenze nella proprietà della fase mobile, della fase stazionaria e della miscela di soluto, i componenti mostrano comportamenti cromatografici diversi durante il processo cromatografico, in modo che i componenti siano separati l'uno dall'altro.

Risoluzione

La risoluzione di un'eluizione è una misura quantitativa di come due picchi di eluizione possono essere differenziati in una separazione cromatografica.

Fattore di correzione
L'analisi quantitativa della cromatografia si basa sul fatto che la quantità di componente è proporzionale all'area di picco ：

Fattore di correzione del peso ：

Metodo quantitativo
Metodo standard esterno
La curva di calibrazione può essere stabilita secondo le seguenti equazioni:

Applicato all'analisi regolare
Vantaggi: facile operazione e calcolo
Carenza: l'accuratezza dei risultati dipende dalla ripetibilità dell'iniezione e dalla stabilità delle condizioni operative.

Metodo standard interno

Aggiungi una certa quantità di sostanza pura nel campione come standard interno.

Intervallo di applicazione: determinare solo diversi componenti del campione e non tutti i picchi dei componenti possono essere fluida
Vantaggi: minore influenza delle condizioni operative, molto precisore e meno restrizioni rispetto al metodo di normalizzazione, adatto all'analisi delle tracce
Carenza: inadatto a un'analisi rapida.

Siringa

L'ago della siringa GC è affilato e l'ago della siringa LC è piatto.

Sperimentare

Condizioni sperimentali
1) Iniettare soluzioni standard di miscelazione da 10 μl (metil paraben, propil paraben e butil paraben) in diverse fasi mobili del metanolo: acqua = 90:10, 80:20 e 70:30 per testare, il tempo di ritenzione dei record e la risoluzione tra i vari componenti, con la risoluzione maggiore di 1,5 e il tempo più breve di selezione della reazione mobile.
Nota: ogni volta che si modifica la fase mobile, è necessario attendere circa 5 minuti per bilanciare il sistema cromatografico (sia le linee di segnale che quella di pressione sono bilanciate).
2) Iniettare soluzioni standard di miscela da 10 μl (metil paraben, propy paraben e butil paraben) a diverse portate di fase mobile di 0,8, 1,0 e 1,5 ml {{url_placeholder_0}} e analisi di iniezione di fase mobili ottimali, lo stesso principio ha selezionato la migliore portata del flusso di fase mobile.

Analisi qualitativa
Nelle condizioni sperimentali ottimali, inietta 10 μl di metil paraben, propil paraben e butil paraben e il tempo di ritenzione di ciascun picco viene registrato.

Analisi quantitativa
Curva di calibrazione
Nelle condizioni sperimentali ottimali, 2, 5, 8, 10, 15 e 20 μL del campione standard misto sono stati iniettati e analizzati e la curva standard è stabilita dal volume di iniezione e dall'area di picco.
È necessario che il coefficiente di correlazione di questa curva sia maggiore di 0,99.

Analisi del campione sconosciuta
Iniettare campioni sconosciuti da 10 μL da testare, analisi quantitativa mediante curva di calibrazione.

Domande
Sulla base dei dati sperimentali, discutere le differenze nei metodi di analisi tra gascromatografia e cromatografia liquida.
Esplora il valore dell'applicazione dell'analisi HPLC.
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