La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è uno strumento chiave per gli scienziati. Permette loro di separare, identificare e misurare le diverse parti di una miscela. La tecnica si basa su come le molecole del campione interagiscono con un liquido (la fase mobile) e un solido (la fase stazionaria). HPLC è noto per fornire risultati precisi e costanti. Ciò lo rende cruciale in molti settori, dal farmaceutico alla sicurezza alimentare. Ma ottenere dati di qualità è’ t è dato. Richiede un sistema HPLC ben mantenuto che funziona al meglio.
Questa guida offre un piano semplice e passo dopo passo per trovare e risolvere problemi comuni. Seguendo questi consigli vi aiuterà a ottenere dati migliori e migliorare il vostro sistema’ prestazioni complessive.
Problemi comuni nel funzionamento HPLC
Conoscere i segni di un problema è il primo passo per risolverlo.
Rumore e deriva della linea di base: la linea di base potrebbe mostrare picchi casuali (rumore) o una pendenza lenta e costante (deriva). Questo può facilmente nascondere piccoli picchi. Inoltre rende molto più difficile ottenere risultati accurati. Le cause abituali sono una fase mobile sporca, oscillazioni di temperatura o una lampada di rilevamento debole.
Retention Time Shifts: Un composto potrebbe eluire prima o più tardi del previsto. Questa incoerenza rende i risultati difficili da ripetere. Questo’ spesso a causa di lievi cambiamenti nella fase mobile, una vecchia colonna, una pompa instabile o cambiamenti di temperatura.
- Scarsa forma del picco (coda, fronte, divisione):
- Tailing: i picchi di coda hanno un'estremità lunga e inclinata. Questo può accadere per due motivi principali. Potresti iniettare troppo campione, o i tuoi composti si attaccano all'imballaggio della colonna.
- Fronting: i picchi di fronte guardano in avanti. Questo è un segno comune che il solvente del campione è molto più forte della fase mobile.
- Divisione: i picchi divisi sembrano due picchi fusi in uno. Questo segnala un problema. Potrebbe essere un ingresso della colonna parzialmente intasato, un vuoto nell'imballaggio della colonna o una cattiva iniezione.
- Fluttuazioni di pressione e blocchi:
- Un aumento costante e lento: questo spesso indica un ostacolo graduale. Le piccole particelle del campione potrebbero accumularsi sulla parte anteriore della colonna o su un filtro.
- Picchi improvvisi di pressione: un forte salto di pressione di solito significa che è appena accaduto un grande blocco.
- Cadute di pressione o instabilità: una rapida caduta di pressione segnala quasi sempre una perdita. Se la pressione sta solo saltando intorno, probabilmente hai bolle d'aria nella pompa.
Risoluzione sistematica dei componenti HPLC
Per risolvere un problema bene, hai bisogno di un piano organizzato. Controllare ogni parte del sistema una per una.
- La fase mobile
Questo è il sangue vitale del vostro sistema. È anche una fonte molto comune di problemi.
Qualità del solvente: iniziare sempre con solventi HPLC di alta purezza. Rendi fresche le tue fasi mobili. Le impurità portano a segnali extra e indesiderati come il rumore di base o i picchi fantasma.
Problemi di pH e tampone: il pH della fase mobile deve essere stabile e corretto. Anche piccoli cambiamenti possono influenzare notevolmente i tempi di ritenzione. Inoltre, assicurarsi che eventuali tamponi siano completamente sciolti e filtrati prima dell'uso.
Degassing: piccole bolle di gas possono causare grandi problemi. Portano a pressioni instabili e picchi nella tua linea di base. Assicurati di degassare bene la tua fase mobile con un degasser integrato, sparging di elio o mettendolo in un bagno ad ultrasuoni.
- La colonna HPLC
La colonna fa tutto il lavoro di separazione. La sua condizione è critica.
Contaminazione e invecchiamento: le colonne si sporcano con l'uso. Le parti di forte legame del vostro campione possono aderire all'imballaggio. Ciò provoca una pressione più alta e forme di picco scarse. La fase stazionaria può anche scomporsi nel tempo, soprattutto a pH molto alto o basso.
Installazione cattiva: una colonna mal collegata può causare problemi. Può perdere o creare “ volumi morti” dove il campione può bloccarsi, portando a picchi larghi o divisi.
- La pompa e l'iniettore
Queste parti sono responsabili di un flusso costante e introduzione pulita del campione.
Seals pompa e valvole di controllo: Seals pompa usura spesso causare perdite e problemi di pressione. Le valvole di controllo difettose portano a un flusso instabile. Ciò rende i tempi di conservazione inaffidabili.
Problemi dell'iniettore e dell'autocampionatore: un iniettore sporco può far sciogliere i picchi o la coda. Con i campionatori automatici, un ago piegato può rovinare l'iniezione. Questo’ s anche vitale per utilizzare un buon solvente di lavaggio per prevenire il trasporto del campione.
- Il rilevatore
Il rilevatore’ Le prestazioni sono fondamentali per ottenere dati di qualità.
Prestazioni della lampada: nei rilevatori UV, una vecchia lampada diventa oscura. Ciò aggiunge più rumore e rende il rilevatore meno sensibile. Dovresti anche controllare la calibrazione della lunghezza d'onda ogni tanto.
Problemi della cellula di flusso: una bolla d'aria intrappolata nella cellula di flusso crea picchi grandi e taglienti sulla linea di base. Se la cellula di flusso è sporca, può fare la deriva della linea di base.
Manutenzione preventiva per un funzionamento HPLC affidabile
La manutenzione regolare è il modo migliore per evitare problemi. Aiuta la tua macchina a durare più a lungo. Inoltre ti assicura di ottenere risultati di cui puoi fidarti.
Lista di controllo della manutenzione preventiva:
Ogni giorno: controllare i livelli di solvente ogni giorno. Cerca le perdite e osserva la pressione del sistema. È anche molto importante risciaccare il sistema dopo l'uso di tamponi per prevenire l'accumulo di sale.
Ogni settimana: asciugare l'esterno della macchina. Controllare la lampada rivelatore’ prestazioni s per vedere se’ sta diventando oscuro.
Ogni mese: pianificare la sostituzione di parti consumabili, come le tenute della pompa e i filtri in linea. Controllare il tubo per eventuali segni di danno.
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Conclusione
Un buon lavoro HPLC è un mix di scienza e abilità pratiche. Seguendo un piano logico, puoi risolvere rapidamente la maggior parte dei problemi. Controllare la fase mobile, poi la colonna, poi la pompa e il rilevatore. Ma ancora più importante è la manutenzione regolare. Questo’ s il modo migliore per evitare arresti sorpresi. Questo semplice impegno è il fattore più importante per ottenere risultati accurati e ripetibili a lungo termine.
Domande frequenti (FAQ)
Q1: Qual è la causa più comune del picco di coda in HPLC?
R: Il picco di coda di solito si verifica a causa di interazioni indesiderate tra i tuoi analiti (soprattutto se sono acidi o basici) e il materiale di silice nella colonna. L'uso di una moderna colonna a cappuccio o la regolazione del pH della fase mobile spesso risolve questo problema. Un'altra ragione chiave è l'iniezione di troppo campione, che può essere fissato diluendo il campione.
Q2: Quante volte devo eseguire la manutenzione del mio sistema HPLC?
A: Questo dipende davvero da quanto lo usi. Per qualsiasi laboratorio occupato, it’ è una buona idea fare controlli rapidi giornalieri (livelli di solventi, pressione). Pianifica le ispezioni settimanali e sostituisci ogni mese le parti indossabili comuni come le tenute della pompa e i filtri, soprattutto se il sistema funziona in modo continuo.
Q3: La mia linea di base sta derivando anche se i miei solventi sono degassati. Quale potrebbe essere la causa?
R: Se sei sicuro che la tua fase mobile sia degassata, la prossima cosa da controllare è la temperatura. Una linea di base derivante è spesso causata da cambiamenti di temperatura intorno al rilevatore o alla colonna. Assicurarsi che la temperatura del forno a colonna sia stabile. Altre possibilità includono una vecchia colonna che sta iniziando a “ sanguinamento” la sua fase stazionaria o una cellula di flusso di rilevatore sporco.
