La chromatographie liquide haute performance (HPLC) est un outil clé pour les scientifiques. Il leur permet de séparer, d’identifier et de mesurer les différentes parties d’un mélange. La technique repose sur la façon dont les molécules d'échantillon interagissent avec un liquide (la phase mobile) et un solide (la phase stationnaire). La HPLC est connue pour donner des résultats précis et stables. Cela le rend essentiel dans de nombreux domaines, des produits pharmaceutiques à la sécurité alimentaire. Mais obtenir des données de qualité est’ t est donné. Il nécessite un système HPLC bien entretenu qui fonctionne au mieux.
Ce guide propose un plan simple et étape par étape pour trouver et résoudre les problèmes communs. Suivre ces conseils vous aidera à obtenir de meilleures données et à améliorer votre système’ performance globale.
Problèmes communs dans l'exploitation HPLC
Connaître les signes d’un problème est la première étape pour le résoudre.
Bruit et dérive de la ligne de base : votre ligne de base peut afficher des pics aléatoires (bruit) ou une pente lente et constante (dérive). Cela peut facilement cacher de petits pics. Cela rend également beaucoup plus difficile d'obtenir des résultats précis. Les causes habituelles sont une phase mobile sale, des variations de température ou une lampe détecteur faible.
Changements de temps de rétention: Un composé peut éluer plus tôt ou plus tard que prévu. Cette incohérence rend les résultats difficiles à répéter. Il’ souvent en raison de légers changements dans votre phase mobile, d'une vieille colonne, d'une pompe instable ou de changements de température.
- Mauvaise forme de pic (tailing, frontage, séparation):
- Tailing: Les pics de tailing ont une extrémité longue et inclinée. Cela peut se produire pour deux raisons principales. Vous pouvez injecter trop d'échantillon, ou vos composés adhèrent à l'emballage de la colonne.
- Frontage : les pics frontaux sont repoussés vers l'avant. C'est un signe commun que votre solvant d'échantillon est beaucoup plus fort que votre phase mobile.
- Split: Split pics ressemblent à deux pics fusionnés en un. Cela signale un problème. Il pourrait s'agir d'une entrée de colonne partiellement obstruée, d'un vide dans l'emballage de colonne ou d'une mauvaise injection.
- Fluctuations de pression et blocages :
- Une hausse constante et lente : cela indique souvent un embouteillage graduel. Les petites particules de votre échantillon peuvent s'accumuler à l'avant de la colonne ou sur un filtre.
- Pics soudains de pression: Un saut brusque de pression signifie généralement qu'un gros blocage vient de se produire.
- Chutes de pression ou instabilité: Une chute de pression rapide signale presque toujours une fuite. Si la pression saute juste, vous avez probablement des bulles d'air dans la pompe.
Dépannage systématique des composants HPLC
Pour bien résoudre un problème, vous avez besoin d'un plan organisé. Vérifiez chaque partie du système une par une.
- La phase mobile
C'est le sang de vie de votre système. C'est aussi une source très fréquente de problèmes.
Qualité du solvant: commencez toujours par des solvants de haute pureté de qualité HPLC. Rendez vos phases mobiles fraîches. Les impuretés entraînent des signaux supplémentaires indésirables comme le bruit de base ou les pics fantômes.
Problèmes de pH et de tampon: Votre pH de phase mobile doit être stable et correct. Même les petits déplacements peuvent grandement affecter les temps de rétention. En outre, assurez-vous que tous les tampons sont complètement dissous et filtrés avant utilisation.
Dégazage: De minuscules bulles de gaz peuvent causer de grands problèmes. Ils entraînent une pression instable et des pics dans votre ligne de base. Assurez-vous de bien dégasser votre phase mobile avec un dégasseur intégré, l'échappement d'hélium ou en la plaçant dans un bain à ultrasons.
- La colonne HPLC
La colonne fait tous les travaux de séparation. Son état est critique.
Contamination et vieillissement : les colonnes se salent avec l’utilisation. Les parties fortement liantes de votre échantillon peuvent adhérer à l'emballage. Cela provoque une pression plus élevée et de mauvaises formes de pic. La phase stationnaire peut également se décomposer au fil du temps, en particulier à pH très élevé ou bas.
Mauvaise installation : une colonne mal connectée peut causer des problèmes. Il peut fuir ou créer “ volumes morts” où l'échantillon peut se coincer, conduisant à des pics larges ou divisés.
- La pompe et l'injecteur
Ces pièces sont responsables d'un flux constant et de l'introduction d'échantillons propres.
Des joints de pompe et des vannes de retenue: Les joints de pompe usés provoquent souvent des fuites et des problèmes de pression. Les valves de retenue défectueuses conduisent à un débit instable. Cela rend vos temps de rétention peu fiables.
Problèmes d'injecteur et d'échantillonneur automatique: Un injecteur sale peut faire des pics scindés ou de la queue. Avec des échantillonneurs automatiques, une aiguille pliée peut gâcher l'injection. Il’ Il est également essentiel d'utiliser un bon solvant de lavage pour éviter le transfert d'échantillons.
- Le détecteur
Le détecteur’ La performance est essentielle pour obtenir des données de qualité.
Performance de la lampe: Dans les détecteurs UV, une ancienne lampe s'estompe. Cela ajoute plus de bruit et rend le détecteur moins sensible. Vous devriez également vérifier l'étalonnage de la longueur d'onde de temps en temps.
Problèmes de cellule d'écoulement: Une bulle d'air piégée dans la cellule d'écoulement crée de grands pics aigus sur la ligne de base. Si la cellule d'écoulement est sale, elle peut faire la dérive de base.
Entretien préventif pour un fonctionnement HPLC fiable
Une maintenance régulière est le meilleur moyen de prévenir les problèmes. Cela aide votre machine à durer plus longtemps. Il vous assure également d'obtenir des résultats en lesquels vous pouvez faire confiance.
Liste de contrôle d'entretien préventif :
Chaque jour: Vérifiez les niveaux de solvant quotidiennement. Recherchez des fuites et observez la pression du système. Il est également très important de rincer le système après avoir utilisé des tampons pour éviter l'accumulation de sel.
Chaque semaine: Essiégez l'extérieur de la machine. Vérifiez la lampe détecteur’ s performance pour voir si il’ s devient dim.
Chaque mois: Faites un plan pour changer les pièces consommables, comme les joints de pompe et les filtres en ligne. Regardez le tuyau pour tout signe de dommage.
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Conclusion
Un bon travail HPLC est un mélange de science et de compétences pratiques. En suivant un plan logique, vous pouvez résoudre la plupart des problèmes rapidement. Vérifiez la phase mobile, puis la colonne, puis la pompe et le détecteur. Mais plus important encore, c’est l’entretien régulier. Il’ s le meilleur moyen d'éviter les arrêts surprises. Cet engagement simple est le facteur le plus important pour obtenir des résultats précis et répétables à long terme.
Foire aux questions (FAQ)
Q1: Quelle est la cause la plus courante de peak tailing dans HPLC?
R: Le pic d'écoulement survient généralement en raison d'interactions indésirables entre vos analytes (surtout s'ils sont acides ou basiques) et le matériau de silice dans la colonne. L'utilisation d'une colonne moderne, capotée ou l'ajustement du pH de la phase mobile résout souvent cela. Une autre raison clé est d'injecter trop d'échantillon, ce qui peut être corrigé en diluant votre échantillon.
Q2: À quelle fréquence dois-je effectuer la maintenance de mon système HPLC?
A: Cela dépend vraiment de combien vous l'utilisez. Pour tout laboratoire occupé, il’ c'est une bonne idée de faire des contrôles rapides quotidiens (niveaux de solvant, pression). Planifiez des inspections hebdomadaires et remplacez les pièces portables courantes comme les joints de pompe et les filtres tous les mois, surtout si le système fonctionne en permanence.
Q3: Mon niveau de base dérive même si mes solvants sont dégazés. Quelle pourrait être la cause?
R: Si vous êtes sûr que votre phase mobile est dégazée, la prochaine chose à vérifier est la température. Une ligne de base dérivante est souvent causée par des changements de température autour du détecteur ou de la colonne. Assurez-vous que la température du four à colonne est stable. D'autres possibilités incluent une ancienne colonne qui commence à “ saignement” sa phase stationnaire ou une cellule d'écoulement détecteur de saleté.
