La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) es un método muy útil. También se conoce como cromatografía de filtración en gel. Se utiliza para separar moléculas en función de su tamaño en una solución. La SEC es diferente. Funciona sobre una base física, no sobre reacciones químicas como otros métodos. Esto lo convierte en una herramienta especial y segura para los científicos. Este artículo explica las ideas básicas de la cromatografía de exclusión de tamaño. Vamos a ver por qué algunas moléculas salen primero y ver cómo se utiliza en la ciencia. Comprender cómo funciona la SEC puede realmente ayudar a sus resultados de laboratorio, sin importar si usted es un estudiante o un profesional en biotecnología.
Principios de cromatografía de exclusión de tamaño
La cromatografía de exclusión de tamaño es una técnica que clasifica las moléculas por su volumen hidrodinámico a medida que pasan por una fase estacionaria porosa. Este método es muy común para purificar proteínas, estudiar polímeros y observar biomoléculas. Vamos’ Explorar las principales ideas que explican cómo la SEC separa las cosas.
Cómo la cromatografía de exclusión de tamaño separa las moléculas
En primer lugar, se introduce una muestra en una columna en la SEC. Esta columna se llena con un material poroso. Estas son a menudo pequeñas perlas de agarosa, dextrano o sílice. La muestra se mueve entonces a través de la columna con un líquido llamado fase móvil. Las moléculas se separan por si pueden encajar en los poros de las perlas. Las moléculas grandes no pueden entrar en los poros pequeños. Por lo tanto, se mueven más rápido entre las perlas. Las moléculas más pequeñas, sin embargo, toman una ruta más larga porque entran en los poros, por lo que salen más tarde. Para ser más exactos, la SEC realmente separa las moléculas por su volumen hidrodinámico. Es la cantidad de espacio que una molécula ocupa en una solución. Tanto la masa como la forma afectan a este volumen. Esta idea básica explica por qué las moléculas salen en un orden específico en la cromatografía de exclusión de tamaño.
El papel del tamaño de los poros en la fase estacionaria
El tamaño de los poros de la fase estacionaria es una parte muy importante de la SEC. Debe elegir materiales con los tamaños de poros adecuados para las moléculas en su muestra. Esto es clave. Por ejemplo, una columna SEC analítica estándar a menudo puede separar moléculas de 10 kDa a 600 kDa. Este rango es ideal para muchas proteínas globulares. Cualquier molécula mayor que 600 kDa se deja totalmente fuera y sale primero en lo que se llama volumen vacío (V). ₀). Por otra parte, las moléculas menores de 10 kDa entran en todos los poros y salen por último, cerca del volumen de permeación total (V). ₜ). Elegir el tamaño correcto de los poros le da la mejor separación. Permite una clara diferencia entre los tamaños moleculares.
Diferencias entre la exclusión de tamaño y otras técnicas cromatográficas
La SEC es bastante diferente de otros métodos de cromatografía. Técnicas como el intercambio iónico o cromatografía de afinidad utilizan interacciones químicas, como carga o unión específica. Pero la SEC separa las moléculas solo por sus propiedades hidrodinámicas. No hay reacciones químicas. Como resultado, la SEC no’ t dañar o cambiar biomoléculas delicadas como proteínas. ¿Qué’ Además, otros métodos como la cromatografía en fase inversa a menudo necesitan disolventes orgánicos. La SEC generalmente solo utiliza tampones a base de agua. Esto lo hace mucho más adecuado para muestras biológicas.
Factores que influyen en el orden de elución
Algunas cosas juegan un papel en el establecimiento del orden de elución en la cromatografía de exclusión de tamaño. Debe controlar estos factores con cuidado para obtener buenos resultados repetibles.
Tamaño y forma moleculares y su impacto en el tiempo de elución
Lo principal que decide el tiempo de elución en SEC es la molécula’ volumen hidrodinámico. Es un concepto simple. Las moléculas más grandes pueden’ t entrar en los poros de la fase estacionaria. Debido a esto, hacen un viaje más corto a través de la columna y salen primeros. Las moléculas más pequeñas pueden entrar en los poros. Por lo tanto, tardan más en pasar y salir más tarde. Esta relación opuesta entre tamaño y tiempo de elución es una característica clave de SEC. Además, es muy importante saber que la forma molecular importa tanto como la masa. Por ejemplo, una proteína larga y delgada de 100 kDa tendrá un volumen hidrodinámico mayor que una proteína redonda con la misma masa, por lo que saldrá antes.
Material de embalaje de columna y estructura de poros
El tipo de material utilizado para empaquetar la columna y su estructura de poros tienen un gran impacto en lo bien que separa las cosas. Se obtienen mejores resultados con materiales que tienen tamaños de poros muy consistentes. Si la estructura de poros no es uniforme, los perfiles de elución pueden extenderse y solaparse. Eso es malo. Por ejemplo, los materiales rígidos a base de sílice se usan a menudo para trabajos de alto rendimiento con moléculas más pequeñas. Por el contrario, los geles a base de agarosa reticulados son generalmente la mejor opción para biomoléculas más grandes como proteínas y anticuerpos.
Velocidad de flujo y composición de fase móvil
El caudal de la fase móvil también afecta cómo eluyen las moléculas. Un caudal más lento da a las moléculas más pequeñas más tiempo para entrar en los poros. Esto mejora la separación. Pero hace que todo el proceso tome más tiempo. La fase móvil, usualmente un tampón, debe seleccionarse cuidadosamente para detener cualquier reacción no deseada entre la muestra y la fase estacionaria. Esto garantiza que la separación se basa solo en el tamaño. Además, a menudo se añade la cantidad adecuada de sal (por ejemplo, NaCl 150 mM) para detener cualquier interacción electrostática aleatoria.
Comportamiento de elución de moléculas
Por qué las moléculas más grandes aparecen antes que las más pequeñas
En la cromatografía de exclusión de tamaño, las moléculas grandes salen primero. Esto sucede porque se mantienen fuera de los poros en la fase estacionaria. No pueden entrar dentro de las perlas. Por lo tanto, solo se mueven a través del volumen vacío, que es el espacio entre las perlas. Esta es la forma más rápida de llegar al final de la columna. Las moléculas más pequeñas son diferentes. Pueden entrar en los poros. Esto hace que su camino sea más largo y aumenta el tiempo que permanecen en la columna.
Rutas a través de la matriz de columnas para diferentes tamaños de moléculas
La ruta que sigue una molécula a través de la columna depende de su tamaño en comparación con el tamaño de los poros.
- Moléculas grandes (exclusión total): Esto evita por completo los poros. Sólo se mueven a través de los espacios entre las perlas.
- Moléculas de tamaño medio (inclusión parcial): Estos pueden entrar en algunos de los poros. Esto conduce a tiempos de elución medios.
- Moléculas pequeñas (inclusión total): Estos pueden entrar en todo el espacio poroso. Esto da como resultado el camino más largo y la última elución.
Limitaciones en la separación basadas en la similitud molecular
La SEC es un método muy bueno. Pero tiene problemas para separar moléculas que tienen aproximadamente el mismo tamaño y forma. Cuando esto sucede, sus tiempos de elución pueden superponerse. El resultado es una mala separación. Los científicos necesitan recordar estos límites cuando planean sus experimentos y analizan sus datos.
Aplicaciones de cromatografía de exclusión de tamaño
Purificación y análisis de proteínas
Uno de los usos más frecuentes de SEC es para la purificación de proteínas. Funciona muy bien para separar proteínas individuales de agrupaciones o impurezas más pequeñas. También se utiliza para estudiar grupos de proteínas y descubrir sus estados oligoméricos. Esto proporciona información importante sobre cómo funcionan en el cuerpo.
Caracterización del polímero
En el mundo de la ciencia de los materiales, SEC se utiliza para encontrar la distribución del peso molecular de los polímeros. Aquí, a menudo se llama cromatografía de permeación en gel (GPC). Esta información es muy importante para conocer un polímero’ propiedades físicas.
Separación de biomoléculas en investigación farmacéutica
En la investigación de fármacos, la SEC es una herramienta clave para el control de calidad de fármacos biológicos, como anticuerpos monoclonales (mAbs), enzimas y ácidos nucleicos. Tiene un papel importante en la creación de nuevos fármacos mediante la medición de grupos grandes y piezas pequeñas. Esto asegura que el medicamento final sea puro y estable.
Consideraciones clave para resultados precisos
Calibración con estándares de peso molecular
Para una buena medición de tamaño, primero debe calibrar el sistema. Esto se hace con estándares de peso molecular. Al ejecutar estándares conocidos, los científicos pueden hacer una curva de calibración. Esta curva traza el volumen de elución contra el log del peso molecular. Para las proteínas, un conjunto común de estándares incluye tiroglobulina (~670 kDa), γ-globulina (~158 kDa), albúmina sérica bovina (BSA, ~66 kDa), ovalbumina (~44 kDa) y mioglobina (~17 kDa). Esta etapa es vital para adivinar el peso molecular de muestras desconocidas.
Importancia de la selección y mantenimiento de columnas
Elegir la columna correcta con el rango de tamaño de poros correcto es crítico. El mantenimiento regular, como limpiarlo y almacenarlo correctamente, ayuda a que la columna dure más y funcione bien cada vez.
Técnicas de preparación de muestras
La preparación de la muestra también es muy importante. Los grupos o las muestras descompuestas pueden arruinar los resultados. Cosas como filtrar o girar la muestra para deshacerse de las partículas pueden ayudar. El uso de tampones que mantengan la muestra estable también puede detener el agrupamiento. Estos pasos aseguran que obtenga buenos datos de la SEC.
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Resumen de Key Insights
El orden de elución de las moléculas es la característica principal de la cromatografía de exclusión de tamaño. Las moléculas más grandes eluyen primero. Esto se debe a la razón de que están excluidos de pasar dentro de los poros de la fase estacionaria y tienen una distancia más corta. Las moléculas más pequeñas pueden penetrar en los poros. Esto les da un camino más largo, por lo que escapan más tarde. Mantener esta regla fácil en su mente es la clave para hacer buenos experimentos y dar sentido a sus datos de laboratorio.
Preguntas frecuentes
Q1: ¿Qué hace que la SEC sea un método preferido para la purificación de proteínas?
R: La SEC es preferida para la purificación de proteínas porque separa las proteínas según el tamaño en su estado nativo sin usar productos químicos extremos. Es un proceso suave. Esto significa que las proteínas son activas y funcionales. Además, la SEC tiene un rendimiento excepcionalmente bueno en la eliminación de aglomerados proteicos, lo que es de importancia muy significativa para la calidad de los fármacos proteicos.
Q2: ¿Cómo puedo mejorar la resolución en los experimentos de la SEC?
R: Para obtener una mejor separación, puede hacer una serie de cosas:
- Utilice una columna con perlas más pequeñas y un buen tamaño de poros para su muestra.
- Usa una columna más larga, que da a las moléculas más espacio para moverse.
- Bajar el caudal. Esto da a las moléculas más tiempo para pasar con la fase estacionaria.
Q3: ¿Es la cromatografía de exclusión de tamaño adecuada para todos los tipos de moléculas?
R: La SEC es muy valiosa, pero’ Es mejor cuando las moléculas son de diferentes tamaños. Puede resultar difícil separar moléculas con volúmenes hidrodinámicos muy similares. Si usted’ Si usted tiene este problema, puede intentar usar SEC junto con otros métodos (como cromatografía de intercambio iónico) para obtener la separación que necesita.
