Nhãn sắc học loại trừ kích thước (SEC), thường được gọi là nhãn sắc học lọc gel, là một phương pháp mạnh mẽ để tách các phân tử dựa trên kích thước của chúng trong hỗn hợp chất lỏng. Nó được sử dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm khoa học, tạo ra y học và nghiên cứu các vật liệu như nhựa.
Cơ sở của phân tử tách theo kích thước
SEC tách các phân tử theo kích thước vật lý của chúng, không phải thành phần hóa học của chúng. Các phân tử lớn ra khỏi cột trước. Chúng không thể phù hợp với các lỗ nhỏ của vật liệu của cột, vì vậy chúng di chuyển nhanh chóng. Các phân tử nhỏ hơn trượt vào những lỗ đó, đi một con đường dài hơn. Điều này cho phép họ thoát ra sau đó. Quá trình này giúp các nhà khoa học nghiên cứu phạm vi kích thước của các phân tử một cách rõ ràng.
Vai trò của giai đoạn cố định xốp trong SEC
Giai đoạn tĩnh trong các cột SEC bao gồm các hạt xốp được làm từ các vật liệu như dextran liên kết chéo, agarose hoặc silica. Những lỗ chân lông này hoạt động như sàng phân tử. Các phân tử quá lớn để vào lỗ chân lông được loại trừ và đi nhanh qua cột, trong khi những phân tử nhỏ hơn khuếch tán vào lỗ chân lông và thoát ra sau đó. Hiệu quả của quá trình này phụ thuộc vào việc chọn một kích thước lỗ chân lông thích hợp phù hợp với phạm vi trọng lượng phân tử được phân tích.
Trong SEC, cột có một vật liệu đặc biệt với các lỗ nhỏ. Các phân tử lớn bỏ qua các lỗ này và chảy qua nhanh chóng. Các phân tử nhỏ đi vào các lỗ, làm chậm chúng. Sự khác biệt này trong đường dẫn chia các phân tử theo kích thước. Kết quả là một sự tách biệt rõ ràng, cho phép các nhà nghiên cứu thấy kích thước lan rộng của mẫu của họ.
Động lực dòng chảy và cơ chế lọc
Giai đoạn di động mang mẫu qua cột trong điều kiện dòng chảy được kiểm soát. Khi các phân tử đi qua giường đóng gói, thời gian giữ của chúng được điều khiển bởi bao nhiêu khối lượng chúng có thể truy cập trong ma trận hạt. Hồ sơ elution thường dẫn đến một đỉnh hình Gaussian cho mỗi loài, với các đỉnh trước đó tương ứng với các phân tử lớn hơn.
Các thành phần cần thiết của hệ thống nhiễm sắc loại trừ kích thước
Để đảm bảo kết quả chính xác và tái tạo trong SEC, một số thành phần cốt lõi phải được tối ưu hóa.
Giai đoạn cố định: Vật liệu đóng gói cột và kích thước lỗ chân lông
Vật liệu đóng gói cột phải vô tính về mặt hóa học và ổn định về mặt cơ học dưới áp suất hoạt động. Các lựa chọn phổ biến bao gồm các gel dựa trên agarose cho các mẫu sinh học và phương tiện truyền thông dựa trên silica cho các polymer hữu cơ. Kích thước lỗ chân khác nhau rất nhiều (ví dụ: 100-1000 Å) để phù hợp với các phạm vi trọng lượng phân tử khác nhau.
Giai đoạn di động: Chọn bộ đệm và khả năng tương thích
Giai đoạn di động nên duy trì độ hòa tan của mẫu và ngăn chặn tương tác với giai đoạn tĩnh. Đối với protein, bộ đệm phốt phat hoặc Tris ở pH sinh lý là phổ biến. Các dung môi hữu cơ có thể được sử dụng cho các polymer tổng hợp. Sự tương thích giữa thành phần pha di động và các phương pháp phát hiện là cần thiết.
Các cột: Kích thước, Xếp hạng áp suất và Loại vật liệu
Các cột SEC có định dạng phân tích (ngắn hơn) hoặc chuẩn bị (dài hơn) tùy thuộc vào quy mô ứng dụng. Chúng phải chịu được áp suất hệ thống mà không biến dạng hoặc rò rỉ. Các cột thép không gỉ hoặc thủy tinh thường được sử dụng dựa trên các yêu cầu tương thích hóa học.
Hệ thống phát hiện: UV-Vis, Chỉ số khúc xạ và phân tán ánh sáng
Hệ thống phát hiện đo nồng độ phân tích khi nó rời khỏi cột. Máy dò UV-Vis phổ biến cho các phân tử sinh học hấp thụ ở bước sóng cụ thể. Máy dò chỉ số khúc xạ cung cấp phát hiện phổ quát nhưng độ nhạy thấp hơn. Sát tán ánh sáng đa góc (MALS) cung cấp thông tin trọng lượng phân tử tuyệt đối mà không có tiêu chuẩn hiệu chuẩn.
Persee cung cấp các giải pháp phát hiện tiên tiến bao gồm máy quang phổ UV-Vis như T7D Double Beam UV-Vis và TU600 UV-Vis Spectrophotometer để tích hợp vào quy trình làm việc SEC.
Chuẩn bị cho một thí nghiệm SEC thành công
Kế hoạch thích hợp đảm bảo độ phân giải và khả năng tái tạo tối ưu trong các thí nghiệm SEC.
Chọn cột phù hợp cho ứng dụng của bạn
Chọn một cột dựa trên phạm vi kích thước và loại mẫu của phân tử mục tiêu của bạn. Ví dụ, protein đòi hỏi các cột tương thích sinh học với giới hạn loại trừ thích hợp (~ 10 kDa đến 600 kDa). Các nghiên cứu polymer có thể cần phạm vi lỗ chân lông rộng hơn.
Chọn điều kiện pha di động phù hợp
Thành phần đệm nên ngăn chặn sự tập hợp hoặc biến hóa các mẫu nhạy cảm trong khi duy trì độ nhớt thấp để bảo tồn độ phân giải. Giảm khí đệm trước khi sử dụng giúp tránh sự hình thành bong bóng có thể làm gián đoạn sự đồng nhất dòng chảy.
Hướng dẫn chuẩn bị mẫu để tối đa hóa độ phân giải
Mẫu cần được lọc (0,22 µm) để loại bỏ các hạt có thể tắc nghẽn cột. Nồng độ nên rơi trong giới hạn tải được khuyến nghị để tránh mở rộng đỉnh do tác dụng quá tải.
Giao thức SEC từng bước cho kết quả nhất quán
Tính nhất quán là chìa khóa khi chạy các giao thức SEC trên các phòng thí nghiệm hoặc thí nghiệm khác nhau.
Quy trình cân bằng cột
Trước khi tiêm mẫu, cân bằng cột với ít nhất 2-3 khối lượng cột của pha di động cho đến khi sự ổn định cơ bản được đạt được trên dấu vết máy dò.
Kỹ thuật tiêm mẫu và cân nhắc khối lượng
Khối lượng tiêm không nên vượt quá 1-5% tổng khối lượng cột để duy trì đỉnh sắc nét. Sử dụng phương pháp tiêm áp suất thấp nếu làm việc với các phân tử sinh học mỏng manh.
Quá trình lọc và tối ưu hóa tỷ lệ dòng chảy
Tốc độ dòng chảy ảnh hưởng đến độ phân giải - tốc độ chậm hơn cải thiện sự tách biệt nhưng tăng thời gian chạy. Tốc độ dòng chảy tối ưu thường dao động từ 0,2-1 mL / phút tùy thuộc vào kích thước cột.
Thu thập dữ liệu và giám sát thời gian thực
Sử dụng các hệ thống tích hợp phần mềm để theo dõi độ hấp thụ hoặc các tín hiệu khác trong quá trình elution trong thời gian thực để nhận được phản hồi ngay lập tức về chất lượng thí nghiệm.
Hệ thống chất lỏng hiệu suất cao L600 của Persee tích hợp kiểm soát chính xác với khả năng giám sát thời gian thực phù hợp cho các ứng dụng nhiễm sắc trong các lĩnh vực khoa học cuộc sống, an toàn thực phẩm, môi trường, giáo dục, hóa dầu.
Tối ưu hóa hiệu suất trong nhiễm sắc loại trừ kích thước
Đạt được hiệu suất tối ưu đòi hỏi cân bằng các thông số hoạt động một cách cẩn thận.
Cân bằng tỷ lệ dòng chảy với hiệu quả độ phân giải
Tốc độ dòng chảy cao hơn làm giảm thời gian phân tích nhưng thỏa hiệp độ phân giải; dòng chậm hơn tăng cường sự tách biệt nhưng mở rộng thời gian chạy - chọn dựa trên các mục tiêu phân tích so với chuẩn bị.
Quản lý tải mẫu để ngăn chặn tác dụng quá tải
Tăng tải quá mức dẫn đến các đỉnh biến dạng do hành vi không tuyến tính; luôn tuân thủ công suất tải được nhà sản xuất khuyến nghị cho mỗi loại cột.
Kiểm soát nhiệt độ để duy trì khả năng tái tạo
Nhiệt độ ảnh hưởng đến độ nhớt của dung môi và tốc độ khuếch tán; sử dụng môi trường kiểm soát nhiệt độ đảm bảo thời gian giữ nhất quán đặc biệt là trong sự tách phân tử sinh học nhạy cảm.
Giải quyết các vấn đề phổ biến của SEC
Khi các vấn đề phát sinh trong một cuộc chạy SEC, chẩn đoán nguyên nhân gốc rễ nhanh chóng có thể tiết kiệm thời gian và nguồn lực.
Hình dạng đỉnh bất thường hoặc mở rộng nguyên nhân và giải pháp
Các đỉnh bất thường có thể là do:
Cân bằng cột không hoàn chỉnh
Đảm bảo sự cân bằng đệm đầy đủ trước khi tiêm; Các dòng cơ sở không ổn định thường chỉ ra thời gian điều hòa không đủ.
Tập hợp mẫu hoặc tương tác
Mẫu lọc trước; thêm chất tẩy rửa nhẹ nếu nghi ngờ sự tích hợp protein; xem xét thay đổi độ bền pH / độ bền ion nếu các tương tác thứ cấp xảy ra với vật liệu đóng gói.
Tốc độ dòng chảy không phù hợp hoặc độ nhớt đệm
Kiểm tra hiệu chuẩn bơm; sử dụng bộ đệm độ nhớt thấp hơn khi có thể; làm chậm tỷ lệ dòng chảy nếu đỉnh xuất hiện quá rộng hoặc xảy ra đuôi.
Thay đổi thời gian lưu trữ
Những thay đổi bất ngờ ở vị trí đỉnh cho thấy các vấn đề cơ bản của hệ thống:
Cột suy thoái hoặc lỗi
Thay thế các cột cũ cho thấy hiệu quả giảm; rửa thường xuyên với dung môi làm sạch sau khi sử dụng để ngăn chặn sự tích tụ của chất ô nhiễm.
Thay đổi trong Mobile Phase Composition
Luôn chuẩn bị bộ đệm tươi bằng cách sử dụng các giao thức nhất quán; Sự biến đổi nhẹ về pH hoặc cường độ ion có thể ảnh hưởng đáng kể đến thời gian giữ lại đặc biệt là đối với các chất phân tích nhạy cảm như protein hoặc axit nucleic.
Máy dò hiệu chuẩn Drift
Điều chỉnh lại máy dò định kỳ bằng cách sử dụng các giải pháp tiêu chuẩn; sự trôi dạt theo thời gian có thể dẫn đến kết quả định lượng không chính xác ngay cả khi sự tách biệt vẫn không thay đổi.
Ứng dụng trên khắp các ngành khoa học
Nhãn sắc học loại trừ kích thước tìm thấy tiện ích rộng rãi trong các lĩnh vực nghiên cứu đa dạng:
Lọc protein trong nghiên cứu hóa sinh học
SEC cho phép thanh lọc chỉ dựa trên kích thước mà không thay đổi cấu trúc protein - lý tưởng như một bước đánh bóng sau các giai đoạn nhiễm sắc tương quan hoặc trao đổi ion.
Phân tích phân phối trọng lượng phân tử polymer
Các nhà hóa học tổng hợp sử dụng SEC kết hợp với chỉ số khúc xạ hoặc máy dò phân tán ánh sáng để xác định chính xác chỉ số phân tán polymer trên phạm vi khối lượng rộng.
Phân tách mảnh DNA trong Genomics
SEC tách các sản phẩm oligonucleotide hoặc PCR theo chiều dài - một lựa chọn thay thế hữu ích khi điện phoresis gel thiếu khả năng mở rộng thông lượng cần thiết bởi các phòng thí nghiệm gen hiện đại.
Liposome và Nanoparticle Characterization in Drug Delivery
SEC phân biệt các phân tử thuốc đóng gói so với các phân tử thuốc tự do trong các công thức liposomal - một bước kiểm soát chất lượng quan trọng trong quá trình phát triển y học nano.
Kiểm soát chất lượng trong sản xuất vắc-xin
Các nhà sản xuất dược phẩm sinh học sử dụng SEC thường xuyên trong các giai đoạn công thức vắc-xin để theo dõi sự hình thành tổng thể có thể ảnh hưởng đến hồ sơ hiệu quả / an toàn hạ lưu.
Lợi thế được cung cấp bởi Nhiễm sắc loại trừ kích thước
SEC cung cấp một số lợi ích hấp dẫn:
Phân tích không phá hủy cho các phân tử nhạy cảm
Vì không có hóa chất khắc nghiệt được liên quan trong quá trình lọc, các phân tử sinh học nhạy cảm duy trì hình dạng bản địa - lý tưởng cho các nghiên cứu sinh học cấu trúc yêu cầu bảo tồn tính toàn vẹn sau các bước thanh lọc.
Giải thích đơn giản dựa trên các đặc tính vật lý
Không giống như các kỹ thuật dựa trên mối quan hệ đòi hỏi các mô hình liên kết phức tạp, SEC hoàn toàn dựa vào sự khác biệt khối lượng thủy lực học - đơn giản hóa sự giải thích dữ liệu đáng kể trên các ứng dụng từ protein đến polymer.
Áp dụng rộng rãi từ phân tích đến luồng công việc chuẩn bị
Cho dù phân tích tạp chất ở mức độ dấu vết phân tích hoặc tinh khiết lượng miligram chuẩn bị - SEC cân một cách hiệu quả mà không hy sinh độ phân giải khi được cấu hình đúng cách bằng cách sử dụng các thiết lập thiết bị phù hợp như hệ thống chất lỏng hiệu suất cao L600 của Persee được thiết kế đặc biệt cho việc tách nhiễm sắc thông lượng cao trên các ngành công nghiệp như thực phẩm & amp; kiểm tra an toàn đồ uống hoặc R & amp; dược phẩm; D đường ống giống nhau.
Hạn chế cần xem xét khi sử dụng SEC
Mặc dù điểm mạnh của nó có những hạn chế mà các học viên phải xem xét:
Không thể giải quyết chính xác các phân tử có kích thước tương tự
Các loài có kích thước gần thường đồng elute trừ khi các cột cực kỳ dài được sử dụng - hạn chế tiện ích nơi phân biệt độ phân giải cao giữa khối lượng gần như giống nhau là cần thiết (ví dụ: các dạng đồng dạng).
Phụ thuộc vào lựa chọn và bảo trì cột thích hợp
Kích thước lỗ chân lông phù hợp kém tạo ra sự tách biệt không tối ưu; bảo trì thường xuyên bao gồm lọc ngược / làm sạch sau khi chạy kéo dài tuổi thọ trong khi bảo tồn khả năng tái tạo trong các chu kỳ sử dụng kéo dài nhiều hơn đáng kể so với việc thay thế phản ứng một mình sẽ cho phép nếu không.
Beijing Purkinje General Instrument Co., Ltd. nổi bật như một đối tác đáng tin cậy cung cấp các giải pháp được chứng nhận phù hợp với các chuyên gia phòng thí nghiệm trên toàn thế giới.
PERSEE: Một đối tác đáng tin cậy trong thiết bị phân tích
PERSEE đã xây dựng danh tiếng của mình từ năm 1991 như một doanh nghiệp công nghệ cao chuyên về R & amp; D, sản xuất, bán hàng - và bây giờ hỗ trợ toàn cầu- cho nhu cầu thiết bị khoa học trên khắp các lĩnh vực từ giáo dục đến hóa dầu.
Công ty đã đạt được thành công các chứng nhận khác nhau bao gồm chứng nhận hệ thống chất lượng ISO9001 và đánh dấu CE, đảm bảo các tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt trong suốt đường ống sản xuất.
Dòng sản phẩm của họ bao gồm các hệ thống HPLC như L600 Chất lỏng hiệu suất caoCác đơn vị GC-MS như M7 tứ cực đơn GC-MS Cùng với máy đo phổ UV-Vis - tất cả đều được hỗ trợ trên toàn cầu thông qua các đội ngũ dịch vụ kỹ thuật có kinh nghiệm.
Tóm tắt các điều quan trọng về giao thức SEC
Nhãn sắc học loại trừ kích thước vẫn là điều không thể thiếu do sự đơn giản của nó kết hợp với tính linh hoạt trên các lĩnh vực - từ proteomics thông qua hóa học polymer.
Phương pháp nhất quán - bao gồm chuẩn bị mẫu đúng cách hiệu chuẩn - rất quan trọng cho kết quả tái tạo.
Lựa chọn dụng cụ đóng một vai trò quan trọng: các giải pháp như những gì được cung cấp bởi Persee cung cấp các nền tảng có thể mở rộng đáp ứng nhu cầu từ phân tích thường xuyên thông qua các ứng dụng nghiên cứu tiên tiến.
Câu hỏi thường gặp:
Q1: Những loại phân tử nào có thể được phân tích bằng cách sử dụng nhiễm sắc loại trừ kích thước?
A: Nhãn sắc học loại trừ kích thước là lý tưởng cho việc phân tích các phân tử lớn như protein, polysaccharide, axit nucleic (DNA / RNA), polymer tổng hợp, liposome, hạt nano - thậm chí là hạt virus - trong cả các thiết lập nghiên cứu và công nghiệp do bản chất không phá hủy của nó chỉ dựa trên sự khác biệt kích thước thủy lực thay vì tương tác hóa học.
Q2: Làm thế nào để lựa chọn giữa các loại máy dò khác nhau khi thiết lập hệ thống SEC?
A: Lựa chọn máy dò phụ thuộc phần lớn vào loại chất phân tích của bạn: UV-Vis hoạt động tốt cho các hợp chất sắc tố như protein / axit nucleic; chỉ số khúc xạ phù hợp với các loài không màu sắc như nhiều polymer; phân tán ánh sáng cung cấp khối lượng molar tuyệt đối độc lập với các tiêu chuẩn - làm cho nó có giá trị khi các đường cong hiệu chuẩn không khả thi.
Q3: Tại sao tôi nên xem xét các dụng cụ Persee cho nhu cầu nhiễm sắc của tôi?
A: Persee cung cấp thiết bị được chứng nhận ISO9001 được thiết kế xung quanh nhu cầu của người dùng bao gồm các hệ thống HPLC L600 tích hợp với các mô-đun phát hiện tiên tiến. Chuyên môn của họ trong nhiều thập kỷ đảm bảo hiệu suất mạnh mẽ được hỗ trợ bởi cơ sở hạ tầng hỗ trợ toàn cầu được tin cậy bởi các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới học thuật và công nghiệp giống nhau.
