Aplicações

Objetivos do experimento
Por experimentos, aprenda os princípios básicos da análise cromatográfica e a operação básica do instrumento e compreenda o processo de análise de dados.
Aprenda sobre métodos quantitativos cromatográficos e compare as vantagens e desvantagens de diferentes métodos.

Introdução ao HPLC
Alta velocidade: o HPLC usa equipamentos de infusão de alta pressão, a taxa de fluxo aumenta bastante e a velocidade de análise é extremamente rápida, apenas alguns minutos em geral;
Eficiente: as partículas de enchimento são muito finas e regulares, o revestimento na fase estacionária é uniforme e a resistência à transferência de massa é pequena, portanto a eficiência da coluna é muito alta.
Alta sensibilidade: O detector é extremamente sensível: UV- 10-9G, detector de fluorescência- 10- 11g.

Comparação HPLC com GC

Objeto e escopo da análise: A análise GC é limitada a gases e compostos estáveis ​​de baixo ferimento, que representam apenas 20% da matéria orgânica total;

A escolha da fase móvel: o GC usa tipos opcionais limitados de gases "inertes" como fase móvel, carregam apenas um pequeno efeito nos componentes.

Temperatura operacional: o GC requer altas temperaturas;
Campos de aplicação
Devido à sua alta sensibilidade, precisão quantitativa e adequada para análise de componentes não voláteis e termicamente instáveis, a análise de separação de HPLC é extremamente versátil em pesquisas industriais e científicas, especialmente em biologia e medicina.

Estrutura e princípio da HPLC

Fig. 1 estrutura HPLC

O HPLC consiste no sistema de bomba, sistema de injeção, sistema de separação, sistema de processamento de detector e dados.

Sistema de infusão de alta pressão
1) garrafa de fase móvel: garrafa de vidro 1-2L com filtro de solvente (liga Ni), seus poros são de aproximadamente 2 μm, impedindo que as partículas bombearem.
2) DeGasser: desgaseificação ultrassônica ou desgaseificação de aquecimento a vácuo.

3) Bomba de alta pressão: os requisitos para a bomba de infusão: boa vedação, fluxo estável sem influxo, ampla faixa ajustável e resistência à corrosão.

Sistema de injeção

Injetor manual ou amostrador automático

Fig.2 Princípio de injeção

Sistema de separação de colunas

Fig.2 Princípio de separação

Fig.3 UVD

Princípio da separação
Processo cromatográfico: em sistemas com duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária, o terceiro componente (ou seja, o soluto ou o adsorbato) é continuamente distribuição alternante entre as duas fases.
Devido às diferenças na propriedade da fase móvel, da fase estacionária e da mistura de soluto, os componentes mostram diferentes comportamentos cromatográficos durante o processo cromatográfico, para que os componentes sejam separados um do outro.

Resolução

A resolução de uma eluição é uma medida quantitativa de quão bem dois picos de eluição podem ser diferenciados em uma separação cromatográfica.

Fator de correção
A análise quantitativa da cromatografia baseia -se em que a quantidade de componente é proporcional à área de pico:

Fator de correção de peso:

Método quantitativo
Método padrão externo
A curva de calibração pode ser estabelecida de acordo com as seguintes equações:

Aplicado à análise regular
Vantagens: Operação e cálculo fácil
Escassez: A precisão dos resultados depende da repetibilidade da injeção e da estabilidade das condições operacionais.

Método padrão interno

Adicione certa quantidade de substância pura à amostra como padrão interno.

Faixa de aplicação: determine apenas vários componentes da amostra, e nem todos os picos dos componentes podem ser fluidos
Vantagens: Menos influência das condições operacionais, muito precate e menos restrições do que o método de normalização, ajuste para análise de rastreamento
Escassez: impróprio para análise rápida.

Seringa

A agulha da seringa GC é nítida e a agulha da seringa LC é plana.

Experimentar

Condições experimentais
1) Injetar soluções padrão de mix de 10μl (metil parabeno, propil parabeno e butil parabeno) em diferentes fases móveis de metanol: água = 90:10, 80:20 e 70:30 para testar o tempo de retenção e a retenção e a resolução entre os vários componentes, com a melhor revolução que 1.5 e o tempo mais curto de retenção.
Nota: Cada vez que você altera a fase móvel, você precisa esperar cerca de 5 minutos para equilibrar o sistema cromatográfico (as linhas de sinal e de pressão são equilibradas).
2) Injetar 10 μl de soluções padrão (parabeno metil, propil parabeno e parabeno de butil) em diferentes taxas de fluxo de fase móvel de 0,8, 1,0 e 1,5 ml {{url_placeholder_0}}} e análise ideal da taxa de reflexão da fase móvel, o mesmo princípio selecionado a melhor taxa de fluxo de fase móvel.

Análise qualitativa
Sob as condições experimentais ideais, injete 10 μl de cada um de metil parabeno, propil parabeno e butil paraben e o tempo de retenção de cada pico é registrado.

Análise quantitativa
Curva de calibração
Sob as condições experimentais ideais, 2, 5, 8, 10, 15 e 20 μl da amostra padrão mista foram injetadas e analisadas, e a curva padrão é estabelecida pelo volume de injeção e área de pico.
É necessário que o coeficiente de correlação dessa curva seja maior que 0,99.

Análise de amostra desconhecida
Injete 10 μl de amostra desconhecida para testar, análise quantitativa por curva de calibração.

Questões
Com base nos dados experimentais, discuta as diferenças nos métodos de análise entre cromatografia gasosa e cromatografia líquida.
Explore o valor da aplicação da análise HPLC.
Se o detector UV é adequado para detectar todo o composto orgânico?