Ứng dụng

Mục tiêu thí nghiệm
Bằng các thí nghiệm, tìm hiểu các nguyên tắc cơ bản của phân tích sắc ký và hoạt động cơ bản của công cụ và hiểu quá trình phân tích dữ liệu.
Tìm hiểu về các phương pháp định lượng sắc ký và so sánh những ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp khác nhau.

Giới thiệu HPLC
Tốc độ cao: HPLC sử dụng thiết bị truyền áp suất cao, tốc độ dòng chảy được tăng lên rất nhiều và tốc độ phân tích cực kỳ nhanh, chỉ một vài phút nói chung;
Hiệu quả: Các hạt phụ rất tốt và đều đặn, lớp phủ trên pha đứng yên là đồng đều và điện trở truyền khối là nhỏ, do đó hiệu suất cột rất cao.
Độ nhạy cao: Máy dò cực kỳ nhạy cảm: UV- 10-9G, máy dò huỳnh quang- 10- 11g.

So sánh HPLC với GC

Đối tượng và phạm vi phân tích: Phân tích GC được giới hạn ở các loại khí và các hợp chất ổn định sôi thấp, chỉ chiếm 20% tổng số chất hữu cơ;

Sự lựa chọn của giai đoạn di động: GC sử dụng các loại khí trơ tùy chọn hạn chế hạn chế làm pha di động, chỉ mang theo, hiệu ứng nhỏ trên các thành phần.

Nhiệt độ hoạt động: GC yêu cầu nhiệt độ cao;
Trường ứng dụng
Do độ nhạy cao, độ chính xác định lượng và phù hợp để phân tích các thành phần không biến động và không ổn định nhiệt, phân tích tách HPLC là cực kỳ linh hoạt trong nghiên cứu công nghiệp và khoa học, đặc biệt là trong sinh học và y học.

Cấu trúc và nguyên tắc HPLC

Hình 1 cấu trúc HPLC

HPLC bao gồm hệ thống bơm, hệ thống phun, hệ thống tách, máy dò và hệ thống xử lý dữ liệu.

Hệ thống truyền áp suất cao
1) Chai pha di động: Chai thủy tinh 1-2L có bộ lọc dung môi (Hợp kim NI), lỗ chân lông của nó xấp xỉ 2 μm, ngăn các hạt không bơm.
2) Degasser: khử khí siêu âm hoặc khử khí nóng chân không.

3) Bơm áp suất cao: Các yêu cầu cho bơm truyền: niêm phong tốt, dòng chảy ổn định mà không có dòng chảy, phạm vi điều chỉnh rộng và khả năng chống ăn mòn.

Hệ thống tiêm

Kẻ phun thủ công hoặc máy lấy mẫu tự động

Hình 2 nguyên tắc tiêm

Hệ thống tách cột

Hình. Nguyên tắc tách

Hình.3 UVD

Nguyên tắc tách biệt
Quá trình sắc ký: Trong các hệ thống có hai pha bất động, pha di động và pha đứng yên, thành phần thứ ba (nghĩa là chất tan hoặc chất hấp phụ) liên tục phân phối xen kẽ giữa hai pha.
Do sự khác biệt trong tính chất của pha di động, pha đứng yên và hỗn hợp chất tan, các thành phần cho thấy các hành vi sắc ký khác nhau trong quá trình sắc ký, để các thành phần được tách ra với nhau.

Nghị quyết

Độ phân giải của một sự rửa giải là một thước đo định lượng về mức độ phân biệt hai điểm rửa giải có thể được phân biệt trong phân tách sắc ký.

Hệ số hiệu chỉnh
Phân tích định lượng của sắc ký dựa trên số lượng thành phần tỷ lệ thuận với diện tích cực đại

Hệ số điều chỉnh cân nặng ：

Phương pháp định lượng
Phương pháp tiêu chuẩn bên ngoài
Đường cong hiệu chuẩn có thể được thiết lập theo các phương trình sau:

Áp dụng để phân tích thường xuyên
Ưu điểm: Hoạt động và tính toán dễ dàng
Thiếu hụt: Độ chính xác của kết quả phụ thuộc vào độ lặp lại của việc tiêm và ổn định của các điều kiện hoạt động.

Phương pháp tiêu chuẩn nội bộ

Thêm một lượng chất nguyên chất nhất định vào mẫu làm tiêu chuẩn nội bộ.

Phạm vi ứng dụng: Chỉ xác định một số thành phần của mẫu và không phải tất cả các đỉnh của các thành phần có thể được chảy
Ưu điểm: Ít ảnh hưởng của điều kiện hoạt động, nhiều trước và ít hạn chế hơn phương pháp chuẩn hóa, phù hợp để phân tích theo dõi
Thiếu hụt: Không phù hợp để phân tích nhanh chóng.

Ống tiêm

Kim của ống tiêm GC rất sắc nét và kim của ống tiêm LC phẳng.

Cuộc thí nghiệm

Điều kiện thí nghiệm
1) Tiêm các giải pháp tiêu chuẩn hỗn hợp 10μl (methyl paraben, propyl paraben và butyl paraben) trong các pha di động khác nhau của metanol: Water = 90:10, 80:20 và 70:30 để kiểm tra, ghi lại thời gian lưu giữ và độ phân giải tốt nhất.
Lưu ý: Mỗi lần bạn thay đổi pha di động, bạn cần đợi khoảng 5 phút để cân bằng hệ thống sắc ký (cả hai đường tín hiệu và áp suất đều được cân bằng).
2) Tiêm 10 dung dịch tiêu chuẩn hỗn hợp (methyl paraben, propyl paraben và butyl paraben) ở các tốc độ dòng pha di động khác nhau là 0,8, 1,0 và 1,5 ml {{url_placeholder_0}} và phân tích tỷ lệ pha di động tối ưu, cùng một nguyên tắc đã chọn tốc độ dòng di động tốt nhất.

Phân tích định tính
Trong các điều kiện thí nghiệm tối ưu, tiêm 10 μl mỗi methyl paraben, propyl paraben và butyl paraben và thời gian lưu của mỗi đỉnh được ghi lại.

Phân tích định lượng
Đường cong hiệu chuẩn
Trong các điều kiện thí nghiệm tối ưu, 2, 5, 8, 10, 15 và 20 μL của mẫu tiêu chuẩn hỗn hợp đã được tiêm và phân tích, và đường cong tiêu chuẩn được thiết lập bằng thể tích phun và diện tích cực đại.
Cần phải có hệ số tương quan của đường cong này lớn hơn 0,99.

Phân tích mẫu chưa biết
Tiêm 10 μl mẫu không xác định để kiểm tra, phân tích định lượng bằng đường cong hiệu chuẩn.

Câu hỏi
Dựa trên dữ liệu thử nghiệm, thảo luận về sự khác biệt trong phương pháp phân tích giữa sắc ký khí và sắc ký lỏng.
Khám phá giá trị ứng dụng của phân tích HPLC.
Liệu máy dò UV có phù hợp để phát hiện tất cả các hợp chất hữu cơ không?