크기 제외 크로마토그래피(SEC)는 매우 유용한 방법입니다.또한 젤 필터링 크로마토그래피로 알려져 있습니다.그것은 용액의 크기에 따라 분자를 분리하는 데 사용됩니다.SEC는 다르다.그것은 다른 방법처럼 화학 반응이 아닌 물리적 기초에서 작동합니다.이것은 과학자들에게 특별하고 안전한 도구입니다.이 기사는 크기 제외 크로마토그래피의 기본 아이디어를 설명합니다.어떤 분자가 먼저 나온 이유를 살펴보고 과학에서 어떻게 사용되는지 살펴보겠습니다.SEC가 어떻게 작동하는지 이해하는 것은 당신이 학생이든 바이오 테크놀로지 전문가든 실험실 결과에 도움이 될 수 있습니다.
크기 제외 크로마토그래피의 원리
크기 제외 크로마토그래피(Size-exclusion chromatography)는 분자를 수동학적 양에 따라 분류하는 기술입니다.이 방법은 단백질을 정화하고, 중합체를 연구하고, 생물 분자를 살펴보는 데 매우 일반적입니다.Let’SEC가 어떻게 물건을 분리하는지 설명하는 주요 아이디어를 탐구합니다.
크기 제외 색소법이 분자를 분리하는 방법
우선, 샘플은 SEC의 열에 넣어집니다. 이 열은 다공성 재료로 채워집니다.이들은 종종 아가로즈, 이이이드렉스트란 또는 실리카의 작은 구슬입니다.샘플은 이동 단계라고 불리는 액체로 열을 통해 이동합니다.분자는 구슬의 구멍에 맞을 수 있는지 여부에 따라 분리됩니다.큰 분자는 작은 구孔에 들어갈 수 없습니다.따라서 그들은 구슬 사이에서 더 빨리 움직입니다.그러나 더 작은 분자는 더 긴 길을 걸어 있기 때문에 그들은 구孔에 들어가기 때문에 나중에 나타납니다.더 정확하게 말하면, SEC는 실제로 분자를 수동학적 양으로 분리합니다.이것은 분자가 용액에서 차지하는 공간의 양입니다.질량과 모양이 모두 이 볼륨에 영향을 미칩니다.이 기본적인 아이디어는 왜 크기 제외 크로마토그래피에서 분자가 특정 순서로 나오는지 설명합니다.
고정 단계에서 구孔 크기의 역할
정상 단계의 구孔 크기는 SEC의 매우 중요한 부분입니다. 샘플의 분자에 대한 적절한 구孔 크기를 가진 재료를 선택해야합니다.이것이 열쇠입니다.예를 들어, 표준 분석 SEC 열은 종종 10 kDa에서 600 kDa까지 분자를 분리할 수 있습니다.이 범위는 많은 구형 단백질에 대해 훌륭합니다.600 kDa 이상의 모든 분자는 완전히 남겨져 공공 볼륨이라고 불리는 것을 먼저 나온다 (V)₀). 반면에, 10 kDa 이하의 분자는 모든 구孔으로 들어가고, 전체 침투량 (V)에 가까운 마지막으로 나타납니다.ₜ). 올바른 모공 크기를 선택하면 가장 좋은 분리를 제공합니다.그것은 분자 크기의 명확한 차이를 가능하게 합니다.
크기 배제와 다른 색상 분석 기술의 차이점
SEC는 다른 크로마토그래피 방법과 매우 다릅니다.이온 교환 또는 친이이이성 크로마토그래피와 같은 기술은 충전이나 특정 결합과 같은 화학적 상호작용을 사용합니다.하지만 SEC는 분자를 수동학적 특성으로만 분리합니다.화학 반응은 없습니다.결과적으로 SEC는’t 단백질과 같은 민감한 생물 분자를 해치거나 변경합니다.What’역단계 크로마토그래피와 같은 다른 방법은 종종 유기 용매를 필요로 합니다.SEC는 보통 물 기반 버퍼만 사용합니다.이것은 생물학적 샘플에 훨씬 더 적합합니다.
배출 순서에 영향을 미치는 요인
크기 제외 크로마토그래피에서 배출 순서를 설정하는 데 몇 가지 역할을 합니다.좋고 반복할 수 있는 결과를 얻기 위해 이러한 요인을 조심스럽게 통제해야합니다.
분자 크기 및 모양 및 배출 시간에 미치는 영향
SEC에서 배출 시간을 결정하는 주요 것은 분자’입니다.s 수역학적 볼륨.그것은 간단한 개념입니다.더 큰 분자는’t는 정지 단계의 구孔에 들어가고 있습니다.이 때문에, 그들은 열을 통해 짧은 여행을 하고 먼저 나온다.더 작은 분자는 구孔에 들어갈 수 있습니다.그래서 그들은 나중에 나오고 나가기 위해 더 오래 걸립니다.크기와 배출 시간 사이의 이러한 반대적인 관계는 SEC의 주요 특징입니다. 또한, 분자 모양이 질량만큼 중요한다는 것을 아는 것이 매우 중요합니다. 예를 들어, 100 kDa의 긴, 스키니 단백질은 동일한 질량을 가진 원형 단백질보다 더 큰 수역학적 볼륨을 가지고 있으므로 더 일찍 나올 것입니다.
열 포장 물자 및 구조
열을 포장하는 데 사용되는 재료의 유형과 그 구조는 물건을 얼마나 잘 분리하는지에 큰 영향을 미칩니다.매우 일관되는 구孔 크기를 가진 재료로 더 나은 결과를 얻습니다.만약 구조가 균등하지 않으면, 배출 프로필은 퍼져 구구구구구성되고 구구구조가 구구구조가 균형적이 없다면, 배출 프로필은 구구구분할 수 있습니다.그것은 나쁜.예를 들어, 단단한 실리카 기반 재료는 종종 작은 분자로 고성능 작업에 사용됩니다.반대로, 십자연결된 아가로즈 기반 대대표 반반대로, 단백질과 항체와 같은 더 큰 생물 분자에 대한 더 나은 선택입니다.
유량 및 이동 단계 구성
이동 단계의 흐름도 분자가 방출하는 방법에 영향을 미칩니다.느린 흐름 속도는 작은 분자들에게 더 많은 시간을 제공합니다.이것은 분리를 개선합니다.그러나 전체 과정은 더 오래 걸립니다.이동 단계, 일반적으로 버퍼, 샘플과 정지 단계 사이에 원치 않는 반응을 중단하기 위해 조심스럽게 선택해야합니다.이것은 분리가 크기에만 기반되는 것을 보장합니다.또한, 적절한 양의 소금 (예를 들어, 150 mM NaCl)은 종종 임의의 정전기 상호 작용을 중단하기 위해 추가됩니다.
분자의 분화 행동
왜 더 큰 분자가 더 작은 분자보다 더 나타나는가?
크기 제외 크로마토그래피에서, 큰 분자가 먼저 나타납니다.이것은 그들이 정지 단계에서 구孔 밖으로 유지되기 때문에 발생합니다.그들은 구슬 안에 들어갈 수 없습니다.따라서, 그들은 구슬 사이의 공간인 빈 볼륨을 통해 이동합니다.이것은 열의 끝까지 가는 가장 빠른 방법입니다.그러나 작은 분자는 다릅니다.그들은 구孔에 들어갈 수 있습니다.이것은 그들의 경로를 더 길게 만들고 열에 머물는 시간을 증가시킵니다.
다른 분자 크기를 위한 열 매트릭스를 통한 경로
분자가 열을 통해 따라가는 경로는 구孔 크기와 비교된 크기에 따라 달라집니다.
- 대분자 (전체 제외): 이것은 완전히 구孔을 피합니다.그들은 구슬 사이의 공간을 통해서만 움직입니다.
- 중간 크기 분자 (부분적 포함): 이들은 일부 구孔에 들어갈 수 있습니다.이것은 중간 배출 시간으로 이어집니다.
- 작은 분자 (전체 포함): 이들은 모든 공간에 들어갈 수 있습니다.이것은 가장 긴 경로와 최신 배출을 가져옵니다.
분자 유사성에 기초한 분리의 한계
SEC는 매우 좋은 방법입니다.그러나 같은 크기와 모양의 분자를 분리하는 데 어려움이 있습니다.이러한 일이 일어날 때, 그들의 배출 시간은 이이이러한 일이 일어날 수 있습니다.그 결과는 나쁜 분리입니다.과학자들은 실험을 계획하고 데이터를 분석할 때 이러한 한계를 기억해야합니다.
크기 제외 크로마토그래피의 응용
단백질 정화 및 분석
SEC의 가장 자주 사용되는 용도 중 하나는 단백질 정화입니다.단일 단백질을 클럼프나 작은 불순물로부터 분리하는 데 매우 잘 작동합니다.또한 단백질 그룹을 연구하고 그들의 oligomeric 상태를 찾기 위해 사용됩니다.이것은 신체에서 어떻게 작동하는지에 대한 중요한 정보를 제공합니다.
중합체 특성
재료 과학의 세계에서 SEC는 폴리머의 분자량 분포를 찾기 위해 사용됩니다.그것은 종종 GelGel Permeation Chromatography(GPC)라고 불립니다.이 정보는 폴리머를 알기 위해 매우 중요합니다’S 물리적 특성
제약 연구에서 생물 분자의 분리
약물 연구에서 SEC는 단일 클론 항체 (mAbs), 효소 및 핵산과 같은 생물학 약물의 품질 관리에 대한 핵심 도구입니다.그것은 큰 클럼프와 작은 조각을 측정함으로써 새로운 약물을 만드는 데 큰 역할을 합니다.이것은 최종 약이 순수하고 안정적이라는 것을 확인합니다.
정확한 결과를 위한 주요 고려사항
분자량 표준으로 교정
좋은 크기 측정을 위해 먼저 시스템을 교정 해야 합니다.이것은 분자량 표준으로 수행됩니다.알려진 표준을 실행함으로써 과학자들은 교정 곡선을 만들 수 있습니다.이 곡선은 분자량의 로그에 대해 배출량을 그림화합니다.단백질의 경우, 일반적인 표준 세트는 Thyroglobulin (~670 kDa), γ-globulin (~158 kDa), Bovine Serum Albumin (BSA, ~66 kDa), Ovalbumin (~44 kDa) 및 Myoglobin (~17 kDa)를 포함합니다.이 단계는 알 수 없는 샘플의 분자량을 추측하는 데 매우 중요합니다.
열 선택 및 유지보수의 중요성
올바른 구孔 크기 범위를 가진 올바른 열을 선택하는 것이 중요합니다.또한, 당신은 그것을 돌볼 필요가 있습니다. 정기적인 유지보수, 청소 및 정확하게 저장하는 것과 같은, 열이 더 오래 지속되고 매번 잘 작동하는 데 도움이 됩니다.
샘플 준비 기술
샘플 준비도 매우 중요합니다.클럼프나 분해된 샘플은 결과를 혼란시킬 수 있습니다.입자를 제거하기 위해 필터링이나 샘플을 회전하는 것과 같은 것들은 도움이 될 수 있습니다.샘플을 안정적으로 유지하는 버퍼를 사용하면 클럼핑을 중단할 수 있습니다.이 단계는 SEC에서 좋은 데이터를 얻는지 확인합니다.
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Key Insights 요약
분자의 배출 순서는 크기 제외 크로마토그래피의 주요 특징입니다.더 큰 분자가 먼저 배출됩니다.이것은 그들이 정지 단계의 구孔 내부를 통과하는 것을 제외하고 더 짧은 거리가 있기 때문입니다.더 작은 분자는 구孔을 침투할 수 있습니다.이것은 그들에게 더 긴 길을 제공하므로 나중에 탈출합니다.이 쉬운 규칙을 마음에 두는 것은 좋은 실험을 하고 실험실 데이터를 이해하는 열쇠입니다.
FAQ
Q1: 무엇이 SEC를 단백질 정화에 선호하는 방법으로 만드는가?
A: SEC는 극단적인 화학 물질을 사용하지 않고 원래 상태의 크기에 따라 단백질을 분리하기 때문에 단백질 정화에 선호됩니다.그것은 부드러운 과정입니다.이것은 단백질이 활동적이고 기능적이라는 것을 의미합니다.또한, SEC는 단백질 집합물을 제거하는 데 특별히 잘 수행하며, 이는 단백질 약물의 품질에 매우 중요합니다.
Q2: 어떻게 SEC 실험에서 해상도를 향상시킬 수 있습니까?
A: 더 나은 분리를 얻기 위해, 여러 가지 일을 할 수 있습니다.
- 더 작은 구슬과 샘플에 대한 좋은 구孔 크기를 가진 열을 사용하십시오.
- 더 긴 열을 사용하여 분자가 움직일 수 있는 공간을 더 많이 제공합니다.
- 유량을 낮추십시오.이것은 분자가 정지 단계로 보내는 더 많은 시간을 제공합니다.
Q3: 크기 제외 크로마토그래피는 모든 유형의 분자에 적합합합니까?
A: SEC는 매우 귀중하지만 it’분자가 크기가 다르면 가장 좋습니다.매우 유사한 수역학적 양의 분자를 분리하는 것이 어려울 수 있습니다.당신이’이 문제가 있으면 SEC를 다른 방법 (이온 교환 크로마토그래피와 같은) 과 함께 사용하여 필요한 분리를 얻을 수 있습니다.
