크기 제외 크로마토그래피 (SEC), 종종 종종크크크기 제외 크로마토그래피라고 불리는 크크기 제외 크로마토그래피 (SEC)는 액체 혼합물의 크기에 따라 분자를 분열하는 강력한 방법입니다.그것은 과학 실험실, 의학 창조 및 플라스틱과 같은 재료의 연구에서 널리 사용됩니다.
크기에 따라 분자 분리의 기초
SEC는 화학적 구성이 아닌 물리적 크기로 분자를 분리합니다.큰 분자가 먼저 열에서 나온다.그들은 열의 재료의 작은 구멍에 맞을 수 없으므로 빠르게 움직입니다.작은 분자들이 그 구멍으로 미끄러지고 더 긴 길을 걸어갑니다.이것은 나중에 나가도록 합니다.이 과정은 과학자들이 분자의 크기 범위를 명확하게 연구하는 데 도움이 됩니다.
SEC의 포어스스타션 페이즈의 역할
SEC 열의 정지 단계는 십자연결된 SEC SEC 열의 정지 단계는 십자연결된 세세세크스트란, 아가로즈 또는 실리카와 같은 재료로 만든 다孔SEC 열의 정지 단계로 구성되어 있습니다.이러한 구孔은 분자 시이이이브로서 작동합니다.구孔에 들어가기 위해 너무 큰 분자는 제외되고 열을 빠르게 통과하지만 작은 분자는 구孔으로 확산되고 나중에 배출됩니다.이 과정의 효과성은 분석되는 분자량 범위와 일치하는 적절한 구孔 크기를 선택하는 것에 달려 있습니다.
SEC에서, 열은 작은 구멍이 있는 특별한 재료를 가지고 있습니다.큰 분자는 이러한 구멍을 건너내고 빠르게 흐르게 됩니다.작은 분자들이 구멍에 들어가서 속도를 느리게 합니다.이 경로의 차이는 크기에 따라 분자를 분할합니다.그 결과는 분명한 분리로 연구자들이 샘플의 크기를 볼 수 있습니다.
흐름 역학 및 배출 메커니즘
이동 단계는 통제 된 흐름 조건에서 이이표본을 열을 통해 운반합니다.분자가 포장된 침대를 통과할 때, 그들의 보존 시간은 구석 매트릭스 내에서 얼마나 많은 볼륨에 액세스할 수 있는지에 따라 결정됩니다. 배출 프로필은 일반적으로 각 종에 대한 가우스 모양의 정점으로 이어집니다. 이전 정점은 더 큰 분자에 대응합니다.
크기 제외 크로마토그래피 시스템의 필수 구성 요소
SEC에서 정확하고 재생할 수 있는 결과를 보장하기 위해 여러 핵심 구성 요소를 최적화해야합니다.
고정 단계: 열 포장 재료 및 구孔 크기
열 포장 재료는 운영 압력에서 화학적으로 비활성이고 기계적으로 안정적이어야합니다.일반적인 선택은 생물학적 샘플을 위한 아가로즈 기반 생생체생생물학적 샘플 및 유기 중합체를 위한 실리카 기반 매체를 포함합니다.구孔 크기는 다양한 분자량 범위를 수용하기 위해 크게 다릅니다 (예를 들어, 100-1000 Å).
모바일 단계: 버퍼 선택 및 호환성
이동 단계는 샘플의 용해성을 유지하고 고정 단계와의 상호 작용을 방지해야합니다.단백질의 경우, 생리학적 pH 인 인산 또는 Tris 버퍼는 일반적입니다.유기 용매는 합성 중합체에 사용될 수 있다.이동 단계 구성과 탐지 방법 사이의 호환성은 필수적입니다.
열: 차원, 압력 등급 및 재료 유형
SEC 열은 애플리케이션 규모에 따라 분석 (짧은) 또는 준비 (긴) 형식으로 제공됩니다.그들은 변형이나 누출없이 시스템 압력을 견고해야합니다.스테인리스 스틸 또는 유리 열은 일반적으로 화학적 호환성 요구 사항에 따라 사용됩니다.
감지 시스템: UV-Vis, 구절 지수 및 광 분산
탐지 시스템은 분석물 농도를 측정합니다.UV-Vis 탐지기는 특정 파장에서 흡수하는 생물 분자에 대해 일반적입니다.구절 지수 감지기는 보편적인 감지를 제공하지만 감도가 낮습니다.다각형 광분산(MALS)은 캘리브레이션 표준없이 절대적인 분자량 정보를 제공합니다.
Persee는 SEC 워크플로우에 통합하기 위해 T7D 더블 PersPersPersPersee UV-Vis 분광광계와 TU600 UV-Vis 분광광광계와 같은 UV-Vis 분광광광계를 포함한 고급 탐지 솔루션을 제공합니다.
성공적인 SEC 실험 준비
적절한 계획은 SEC 실험에서 최적의 해상도와 재생성을 보장합니다.
응용 프로그램에 적합한 열을 선택
목표 분자의 크기 범위와 샘플 유형에 따라 열을 선택합니다.예를 들어 단백질은 적절한 배제 한계 (~10 kDa ~ 600 kDa)를 가진 생물 호환성 열을 필요로합니다.폴리머 연구는 더 넓은 구孔 범위를 필요로 할 수 있습니다.
올바른 모바일 단계 조건을 선택
버퍼 구성은 해상도를 보존하기 위해 낮은 점도를 유지하면서 민감한 샘플의 집합이나 변화를 방지해야합니다.사용하기 전에 버퍼를 제가스하면 흐름의 균일성을 방해할 수 있는 거품 형성을 방지할 수 있습니다.
해상도를 최대화하기 위한 샘플 준비 지침
샘플은 열을 막을 수 있는 입자를 제거하기 위해 필터링해야합니다 (0.22 µm).농도는 과부하 효과로 인한 최대 확장을 피하기 위해 권장 된 부하 한계 내에 떨어져야합니다.
일관된 결과를 위한 단계별 SEC 프로토콜
SEC 프로토콜을 다른 실험실이나 실험에서 실행할 때 일관성이 중요합니다.
열 균형 절차
샘플 주입 전에, 검출기 추적에서 기본선 안정성을 달성할 때까지 적어도 2-3 개의 이동 단계 열 볼륨으로 열을 균형화하십시오.
샘플 주입 기술 및 볼륨 고려 사항
주입 양은 날카로운 피크를 유지하기 위해 전체 열 양의 1~5%를 초과해서는 안됩니다.취약한 생물 분자를 사용하는 경우 저압 주입 방법을 사용하십시오.
배출 공정 및 유량 최적화
흐름속도는 해상도에 영향을 미칩니다. 느린 속도는 분리를 향상시키지만 실행 시간을 증가시킵니다.최적의 유량은 일반적으로 열 치수에 따라 0.2-1 mL/min의 범위입니다.
데이터 수집 및 실시간 모니터링
소프트웨어 통합 시스템을 사용하여 실험 품질에 대한 즉각적인 피드백을 얻기 위해 실시간으로 배출 중 흡수 또는 기타 신호를 모니터링합니다.
Persee의 L600 고성능 액체 시스템은 생명과학, 식품 안전, 환경, 교육, 석유화학 분야에서 크로마토그래피 응용 프로그램에 적합한 실시간 모니터링 기능과 정밀 제어를 통합합니다.
크기 제외 크로마토그래피에서 성능 최적화
최적의 성능을 달성하려면 작동 매개 변수를 조심스럽게 균형화해야 합니다.
해상도 효율성과 유량의 균형
높은 유량은 분석 시간을 줄이지만 해상도를 타협합니다.느린 흐름은 분리를 향상시키지만 런타임을 확장합니다. 분석 및 준비 목표에 따라 선택하십시오.
과부하 효과를 방지하기 위해 샘플 로드 관리
과부하는 비선형 행동으로 인해 왜곡된 피크로 이어집니다.항상 열 유형 당 제조업체가 권장하는 부하 용량을 준수하십시오.
재생성을 유지하기 위해 온도 제어
온도는 용매의 점도와 확산 속도에 영향을 미칩니다.온도 제어 환경을 사용하면 특히 민감한 생물 분자 분리에서 일관된 보존 시간을 보장합니다.
일반적인 SEC 문제 해결
SEC 실행 중에 문제가 발생할 때 근본 원인을 빠르게 진단하면 시간과 자원을 절약할 수 있습니다.
불규칙한 피크 모양 또는 확장 원인 및 솔루션
불규칙한 피크는 다음과 같이 발생할 수 있습니다.
불완전한 열 균형
주입 전에 충분한 버퍼 균형을 보장;불안정한 기준선은 종종 조절 시간이 부족하다는 것을 나타냅니다.
샘플 집합 또는 상호 작용
사전 필터 샘플;단백질 집합이 의심되는 경우 부드러운 세제를 추가하십시오.포장 재료와 이차 상호 작용이 발생하는 경우 버퍼 pH/이온 강도를 변경하는 것을 고려하십시오.
부적절한 유량 또는 버퍼 점도
펌프 교정 확인;가능한 경우 낮은 점도 버퍼를 사용하십시오.피크가 너무 넓게 나타나거나 테일링이 발생하는 경우 유량을 느리게 합니다.
유지 시간 변환
최고 위치의 예상치 못한 변화는 기본적인 시스템 문제를 제시합니다.
열 degradation 또는 fouling
감소된 효율성을 보여주는 오래된 열을 교체하십시오.오염물질의 축적을 방지하기 위해 사용 후 청소 용매로 정기적으로 사용사용사용하십시오.
모바일 단계 구성 변경
항상 일관된 프로토콜을 사용하여 신선한 버퍼를 준비하십시오.약간의 pH 또는 이온 강도 변화는 특히 단백질이나 핵산과 같은 민감한 분석물에 대한 보존 시간에 크게 영향을 미칠 수 있습니다.
탐지기 교정 드리프트
표준 솔루션을 사용하여 감지기를 정기적으로 재교정;시간이 지남에 따라 드리프트는 분리가 변하지 않으더라도 부정확한 양화 결과로 이어질 수 있습니다.
과학 분야에 걸쳐 응용 프로그램
크기 제외 크로마토그래피는 다양한 연구 분야에서 광범위한 유용성을 찾습니다.
생화학 연구에서 단백질 정화
SEC는 단백질 구조를 변경하지 않고 크기에 따라 정화를 가능하게 합니다. 이는 친화 또는 이온 교환 크로마토그래피 단계를 따라 이이이상적인 SEC는 연결 단계로 이상적입니다.
중합체 분자량 분포 분석
합성 화학자들은 광범위한 질량 범위에 걸쳐 중합체 분산 지수를 정확하게 결정하기 위해 구절 지수 또는 광 분산 탐지기와 결합된 SEC를 사용합니다.
Genomics에서 DNA Fragment Separation
SEC는 올리고누클리오티드 또는 PCR 제품을 길이에 따라 분리합니다. GelGel젤 전기증이 현대 유전체학 실험실에 필요한 처리량 확장성이 부족할 때 유용한 대안입니다.
약물 배달의 지방체와 나노 입자 특징화 Liposome and Nanoparticle Characterization in Drug Delivery
SEC는 liposomal formulations-nanomedicine 개발 과정에서 중요한 품질 관리 단계 내에서 SECSEC포함된 vs 자유로운 약물 분수를 구별합니다.
백신 생산의 품질 관리
바이오제약 제조업체는 백신 제조 단계 동안 SEC를 일상적으로 사용하여 효과/안전 프로필에 영향을 미칠 수 있는 집합 형성을 모니터링합니다.
크기 제외 크로마토그래피에 의해 제공되는 이점
SEC는 여러 가지 매력적인 혜택을 제공합니다.
민감한 분자에 대한 비파괴적 분석
배출 중에 거친 화학 물질이 관련되지 않기 때문에 민감한 생물 분자는 정화 후 무결성 보존 단계를 필요로 하는 구조 생물학 연구에 이상적인 원래 형성을 유지합니다.
물리적 특성을 기반으로 간단한 해석
복잡한 결합 모델을 요구하는 친화성 기반 기술과는 달리, SEC는 단순히 수력 역학적 볼륨 차이에 의존하여 단백질에서 중합체까지 다양한 응용 프로그램에서 데이터 해석을 실질적으로 간소화합니다.
분석에서 준비 워크플로우까지 광범위한 적용 가능성
추적 수준의 불순물을 분석적으로 분석하거나 밀리그램 양을 준비적으로 정화하든 SEC는 식품 및 기술과 같은 산업 전반에서 고처량 크로마토그래픽 분리를 위해 특별히 설계된 Persee의 L600 고성능 액체 시스템과 같은 적절한 계기 설정을 사용하여 제대로 구성할 때 해상도를 희생하지 않고 효율적으로 스케일합니다.음료 안전 시험 또는 약제 R&D 파이프라인도 같습니다.
SEC를 사용할 때 고려해야 할 제한 사항
강점에도 불구하고 연습자가 고려해야 할 한계가 있습니다.
비슷한 크기의 분자를 정확하게 해결할 수 없음
가까운 크기의 종은 매우 긴 열이 사용되지 않는 한 종종 공동 배출되며, 거의 동일한 질량 사이의 고해상도 차별이 필수적인 경우 유용성을 제한합니다 (예를 들어, isoforms).
적절한 열 선택 및 유지보수에 대한 의존성
잘 일치하지 않은 구孔 크기는 최적의 분리를 생산합니다.실행 후 백플러시/청소를 포함한 정기적인 유지보수는 연장된 사용 주기에 걸쳐 재생 가능성을 보존하면서 수명을 연장합니다.
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SEC 프로토콜에 대한 주요 요약
크기 제외 크로마토그래피는 단순성과 단백질 공학에서 중합체 화학까지 다양한 분야의 다재성을 결합하여 필수적입니다.
적절한 샘플 준비를 포함한 일관된 방법론캘리브레이션은 재생 가능한 결과에 필수적입니다.
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FAQ는:
Q1: 크기 제외 크로마토그래피를 사용하여 어떤 유형의 분자를 분석할 수 있습니까?
A: 크기 제외 크로마토그래피는 단백질, 다당산, 핵산 (DNA / RNA), 합성 중합체, 지방체, 나노 입자 - 심지어 바이러스 입자 - 연구 및 산업 환경에서 화학적 상호 작용보다는 수역학적 크기 차이를 기반으로 하는 비파괴적 인 성격으로 인해 매크로 분자를 분석하는 데 이상적입니다.
Q2: SEC 시스템을 설정할 때 다양한 유형의 탐지기 중 어떻게 선택합니까?
A: 탐지기 선택은 대부분 분석제 유형에 달려 있습니다: UV-Vis는 단백질/핵산과 같은 염색 화합물을 위해 잘 작동합니다;refractive index는 많은 중합체와 같은 비 염색 종에 적합합니다.빛 분산은 표준과 독립적으로 절대적인 모러 질량을 제공하므로 교정 곡선이 실행 가능하지 않은 곳에서 가치가 있습니다.
Q3: 왜 내 크로마토그래피 요구에 Persee 장치를 고려해야합니까?
A: Persee는 고급 탐지 모듈과 통합된 L600 HPLC 시스템을 포함하여 사용자 요구에 따라 설계된 ISO9001 인증 장비를 제공합니다.수십 년간의 전문 지식은 학술 분야에서 실험실이 신뢰하는 글로벌 지원 인프라에 의해 지원되는 견고한 성능을 보장합니다.산업도 마찬가지다.
