أخبار

كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) ، وغالبا ما تسمى كروماتوغرافيا ترشيح هلام ، هي طريقة قوية لتقسيم الجزيئات بناء على حجمها في خليط سائل. يستخدم على نطاق واسع في مختبرات العلوم وخلق الطب ودراسات المواد مثل البلاستيك.

أساس الفصل الجزيئي حسب الحجم

تفصل SEC الجزيئات بحجمها المادي وليس مكياجها الكيميائي. الجزيئات الكبيرة تخرج من العمود أولاً. لا يمكنهم تناسب الثقوب الصغيرة في مواد العمود ، لذلك يتحركون بسرعة. الجزيئات الأصغر تنزلق في تلك الثقوب، واتخاذ مسار أطول. وهذا يسمح لهم بالخروج في وقت لاحق. تساعد هذه العملية العلماء على دراسة نطاق حجم الجزيئات بوضوح.

دور المرحلة الثابتة المسامية في SEC

تتكون المرحلة الثابتة في أعمدة SEC من الخرز المسامية المصنوعة من مواد مثل الدكستران المترابط ، والأجاروز ، أو السيليكا. هذه المسام تعمل كمراقب جزيئية. الجزيئات الكبيرة جدا لدخول المسام يتم استبعادها وتمر بسرعة من خلال العمود، في حين أن الجزيئات الأصغر تنتشر في المسام وتخرج في وقت لاحق. تعتمد فعالية هذه العملية على اختيار حجم المسام المناسب الذي يتطابق مع نطاق الأوزان الجزيئية التي يتم تحليلها.

في SEC ، يحتوي العمود على مادة خاصة مع ثقوب صغيرة. الجزيئات الكبيرة تتخطى هذه الثقوب وتتدفق بسرعة. الجزيئات الصغيرة تدخل الثقوب وتبطئها. هذا الاختلاف في المسارات يقسم الجزيئات حسب الحجم. والنتيجة هي فصل واضح، مما يتيح للباحثين رؤية انتشار حجم عينتهم.

ديناميكيات التدفق وآلية التخلص

المرحلة المتنقلة تحمل العينة من خلال العمود تحت ظروف التدفق المسيطر عليها. عندما تمر الجزيئات عبر السرير المعبأ ، يحكم وقت الاحتفاظ بها كم من الحجم يمكنها الوصول إليه داخل مصفوفة الخرز. عادة ما يؤدي ملف تعريف الإفلات إلى قمة على شكل غاوس لكل نوع ، مع قمم سابقة تتوافق مع جزيئات أكبر.

المكونات الأساسية لنظام الكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم

لضمان نتائج دقيقة وقابلة للتكرار في SEC ، يجب تحسين العديد من المكونات الأساسية.

المرحلة الثابتة: مواد التعبئة العمود وأحجام المسام

يجب أن تكون مواد التعبئة الخاملة كيميائيا ومستقرة ميكانيكيا تحت ضغوط التشغيل. وتشمل الخيارات الشائعة الجيلات القائمة على الاجاروز للعينات البيولوجية والوسائط القائمة على السيليكا للبوليمرات العضوية. تختلف أحجام المسام على نطاق واسع (على سبيل المثال ، 100-1000 Å) لاستيعاب نطاقات الوزن الجزيئي المختلفة.

مرحلة الجوال: اختيار العازلة المؤقتة والتوافق

يجب على المرحلة المتنقلة الحفاظ على قابلية ذوبان العينة ومنع التفاعلات مع المرحلة الثابتة. بالنسبة للبروتينات ، فإن عازلات الفوسفات أو تريس عند درجة الحموضة الفسيولوجية شائعة. يمكن استخدام المذيبات العضوية للبوليمرات الصناعية. التوافق بين تكوين المرحلة المتنقلة وطرق الكشف ضروري.

الأعمدة: الأبعاد، تقييمات الضغط، وأنواع المواد

تأتي أعمدة SEC في تنسيقات تحليلية (أقصر) أو تحضيرية (أطول) حسب مقياس التطبيق. يجب أن تتحمل ضغوط النظام دون تشوه أو تسرب. عادة ما تستخدم أعمدة الفولاذ المقاوم للصدأ أو الزجاج بناء على متطلبات التوافق الكيميائي.

أنظمة الكشف: الأشعة فوق البنفسجية، مؤشر الانكسار، وتشتت الضوء

تقيس أنظمة الكشف تركيز التحليل عند خروجه من العمود. كاشفات الأشعة فوق البنفسجية شائعة لامتصاص الجزيئات الحيوية في أطوال موجية محددة. كاشفات مؤشر الانكسار توفر الكشف العالمي ولكن حساسية أقل. يوفر تشتت الضوء متعدد الزوايا (MALS) معلومات عن الوزن الجزيئي المطلق دون معايير المعايرة.

تقدم Persee حلول الكشف المتقدمة بما في ذلك مقياسات الطيف UV-Vis مثل T7D Double Beam UV-Vis و TU600 UV-Vis Spectrophotometer للتكامل في سير عمل SEC.

التحضير لتجربة SEC الناجحة

التخطيط الصحيح يضمن الدقة الأمثل وإمكانية التكرار في تجارب SEC.

اختيار العمود المناسب لتطبيقك

اختر عمودًا بناءً على نطاق حجم الجزيء المستهدف ونوع العينة. على سبيل المثال، تتطلب البروتينات أعمدة متوافقة بيولوجيا مع حدود الاستبعاد المناسبة (~ 10 كيلو داتا إلى 600 كيلو داتا). قد تحتاج دراسات البوليمر إلى نطاقات مسام أوسع.

اختيار شروط المرحلة المحمولة الصحيحة

يجب أن تمنع تكوين العازل تجميع أو تحول طبيعة العينات الحساسة مع الحفاظ على لزجة منخفضة للحفاظ على الدقة. تساعد إزالة الغازات العازلة قبل الاستخدام على تجنب تشكيل الفقاعات التي يمكن أن تعطل توحيد التدفق.

مبادئ توجيهية لإعداد العينات لتحقيق أقصى قدر من الدقة

يجب تصفية العينات (0.22 ميكرومتر) لإزالة الجسيمات التي يمكن أن تسد العمود. يجب أن يقع التركيز ضمن حدود التحميل الموصى بها لتجنب التوسع القصوى الناجم عن آثار التحميل الزائد.

بروتوكول SEC خطوة بخطوة لتحقيق نتائج متسقة

الاتساق هو المفتاح عند تشغيل بروتوكولات SEC عبر مختبرات أو تجارب مختلفة.

إجراءات موازنة العمود

قبل حقن العينة ، توازن العمود مع ما لا يقل عن 2-3 أحجام عمود من المرحلة المتنقلة حتى يتم تحقيق استقرار خط الأساس على أثر الكاشف.

تقنيات حقن العينات والاعتبارات الحجمية

يجب ألا تتجاوز أحجام الحقن 1-5٪ من إجمالي حجم العمود للحفاظ على القمم الحادة. استخدم طرق حقن ضغط منخفض إذا كنت تعمل مع الجزيئات الحيوية الهشة.

عملية التخلص وتحسين معدل التدفق

تؤثر معدل التدفق على القرار - تحسن معدلات أبطأ الفصل ولكن تزيد من وقت التشغيل. عادة ما تتراوح معدلات التدفق المثلى بين 0.2-1 مل / دقيقة حسب أبعاد العمود.

اكتساب البيانات والمراقبة في الوقت الحقيقي

استخدم أنظمة متكاملة بالبرمجيات لمراقبة الامتصاص أو إشارات أخرى أثناء التخلص في الوقت الحقيقي للحصول على ردود فعل فورية على جودة التجربة.

يدمج نظام السوائل عالية الأداء L600 من Persee التحكم الدقيق مع قدرات المراقبة في الوقت الحقيقي المناسبة لتطبيقات الكروماتوغرافيا في جميع قطاعات علوم الحياة وسلامة الأغذية والبيئة والتعليم والبتروكيماويات.

تحسين الأداء في الكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم

يتطلب تحقيق الأداء الأمثل توازن معايير التشغيل بعناية.

توازن معدل التدفق مع كفاءة القرار

معدلات تدفق أعلى تقلل من وقت التحليل ولكن تساوي الحل. تدفقات أبطأ تعزز الفصل ولكن تمدد وقت التشغيل - اختر بناء على الأهداف التحليلية مقابل التحضيرية.

إدارة حمولة العينات لمنع آثار التحميل الزائد

يؤدي التحميل الزائد إلى قمم مشوهة بسبب السلوك غير الخطي. تلتزم دائما بقدرات التحميل الموصى بها من قبل المصنع لكل نوع عمود.

التحكم في درجة الحرارة للحفاظ على التكرار

تؤثر درجة الحرارة على لزوجة المذيبات ومعدلات الانتشار. يضمن استخدام البيئات التي تتحكم في درجة الحرارة أوقات الاحتفاظ المتسقة خاصة في الفصل الجزيئي الحيوي الحساس.

إصلاح مشاكل SEC الشائعة

عندما تنشأ مشاكل أثناء تشغيل SEC ، فإن تشخيص الأسباب الجذرية بسرعة يمكن أن يوفر الوقت والموارد.

أشكال القمة غير المنتظمة أو الأسباب والحلول الموسعة

قد تنتج القمم غير المنتظمة عن:

توازن العمود غير الكامل

ضمان توازن العازلة الكافي قبل الحقن؛ خطوط الأساس غير المستقرة غالبا ما تشير إلى عدم كفاية وقت التكييف.

تجميع العينات أو التفاعل

عينات ما قبل الترشيح؛ إضافة منظفات خفيفة إذا كان يشتبه في تجميع البروتين ؛ النظر في تغيير درجة الحموضة العازلة / قوة الأيونات إذا حدثت تفاعلات ثانوية مع مواد التعبئة والتغليف.

معدل تدفق غير مناسب أو لزوجة العازلة

تحقق من معايرة المضخة؛ استخدام مخازن ذات لزوجة أقل حيثما أمكن؛ إبطاء معدل التدفق إذا ظهرت القمم واسعة بشكل مفرط أو حدث التخلف.

تغييرات وقت الاحتفاظ

تشير التحولات غير المتوقعة في موقف الذروة إلى مشاكل النظام الأساسية:

تدهور العمود أو الفول

استبدل الأعمدة القديمة التي تظهر انخفاض الكفاءة. شطف بانتظام مع المذيبات التنظيفية بعد الاستخدام لمنع تراكم الملوثات.

تغييرات في تكوين المرحلة المتنقلة

دائما إعداد مخازن جديدة باستخدام بروتوكولات متسقة؛ يمكن أن تؤثر الاختلافات الطفيفة في درجة الحموضة أو قوة الأيونات بشكل كبير على أوقات الاحتفاظ خاصةً للمحللات الحساسة مثل البروتينات أو الأحماض النووية.

كاشف المعايرة الانجراف

إعادة معايرة الكاشفات بشكل دوري باستخدام الحلول القياسية؛ يمكن أن يؤدي الانجراف مع مرور الوقت إلى نتائج قياس غير دقيقة حتى لو بقي الفصل دون تغيير.

التطبيقات عبر التخصصات العلمية

تجد الكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم فائدة واسعة عبر مجالات البحث المتنوعة:

تنقية البروتين في أبحاث الكيمياء الحيوية

يسمح SEC بالتنقية بناءً فقط على الحجم دون تغيير هيكل البروتين - مثالي كخطوة تلميع بعد مراحل الكروماتوغرافيا للترابط أو تبادل الأيونات.

تحليل توزيع الوزن الجزيئي للبوليمر

يستخدم الكيميائيون الاصطناعيون SEC إلى جانب مؤشر الانكسار أو كاشفات تشتت الضوء لتحديد مؤشرات تشتت البوليمر بدقة عبر نطاقات كتلة واسعة.

فصل شظايا الحمض النووي في علم الجينوم

تفصل SEC أوليغونوكليوتيدات أو منتجات PCR حسب الطول - وهو بديل مفيد عندما يفتقر الكهرباء الهيلية إلى قابلية التوسع في الإنتاج المطلوبة من قبل مختبرات علم الجينوم الحديثة.

وصف الليبوسوم والجزيئات النانوية في توصيل الأدوية

تميز SEC الكسور المخبأة مقابل الأدوية الحرة داخل صيغ الدهون - خطوة مهمة لمراقبة الجودة أثناء عمليات تطوير الطب النانوي.

مراقبة الجودة في إنتاج اللقاحات

يستخدم مصنعو الأدوية الحيوية SEC بشكل روتيني خلال مراحل صياغة اللقاحات لمراقبة تكوين التجمعات التي يمكن أن تؤثر على ملامح الفعالية / السلامة في المستقبل.

المزايا التي تقدمها الكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم

تقدم SEC عدة فوائد مقنعة:

تحليل غير مدمر للجزيئات الحساسة

بما أنه لا توجد مواد كيميائية قاسية متورطة أثناء التخلص، فإن الجزيئات الحيوية الحساسة تحتفظ بالتشكيل الأصلي - وهو مثالي لدراسات علم الأحياء الهيكلي التي تتطلب خطوات الحفاظ على السلامة بعد التنقية.

التفسير المباشر على أساس الخصائص الفيزيائية

على عكس التقنيات القائمة على الارتباط التي تتطلب نماذج ربط معقدة، تعتمد SEC على اختلافات الحجم الهيدروديناميكية بحتة - تبسيط تفسير البيانات بشكل كبير عبر التطبيقات التي تتراوح من البروتينات إلى البوليمرات على حد سواء.

تطبيق واسع من سير العمل التحليلي إلى التحضيري

سواء كان تحليل الشوائب على مستوى النزر تحليليا أو تنقية كميات ملليغرام تحضيرا - قياس SEC بكفاءة دون التضحية بالدقة عند تكوينها بشكل صحيح باستخدام إعدادات الأجهزة المناسبة مثل نظام السوائل عالية الأداء L600 من Persee المصمم خصيصا للفصل الكروماتوغرافي عالي الإنتاجية عبر الصناعات مثل الأغذية والأغذية. اختبار سلامة المشروبات أو البحث والدواء D خطوط الأنابيب على حد سواء.

القيود التي يجب مراعاتها عند استخدام SEC

على الرغم من نقاط قوتها هناك قيود يجب على الممارسين مراعاتها:

عدم القدرة على حل الجزيئات ذات الحجم المماثل بدقة

الأنواع ذات الحجم القريب غالبا ما تتعاون ما لم يتم استخدام أعمدة طويلة للغاية - مما يحد من الفائدة حيث يكون التمييز عالي الدقة بين كتل متطابقة تقريبا ضروريا (على سبيل المثال ، أشكال متطابقة).

الاعتماد على اختيار العمود الصحيح والصيانة

أحجام المسام المتطابقة بشكل سيء تؤدي إلى فصل دون المثالي. الصيانة المنتظمة بما في ذلك التنظيف بعد التشغيل تمدد العمر مع الحفاظ على التكرار على دورات الاستخدام الممتدة أكثر بكثير مما تسمح الاستبدالات التفاعلية وحدها خلاف ذلك.

بيجينج بوركينجي جنرال إنسترومنت كو، المحدودة تبرز كشريك موثوق يقدم حلول معتمدة مصممة خصيصا لمهنيي المختبرات في جميع أنحاء العالم.

PERSEE: شريك موثوق به في الأدوات التحليلية

برسي لقد بنيت سمعتها منذ عام 1991 كمؤسسة عالية التكنولوجيا متخصصة في البحث والتطوير. د، التصنيع، المبيعات - والآن الدعم العالمياحتياجات الأدوات العلمية عبر القطاعات من التعليم إلى البتروكيماويات.

حصلت الشركة بنجاح على شهادات مختلفة بما في ذلك شهادة نظام الجودة ISO9001 ووسم CE ، مما يضمن معايير مراقبة الجودة الصارمة في جميع أنحاء خطوط الإنتاج.

خطوط منتجاتهم تمتد أنظمة HPLC مثل L600 السائل عالي الأداءوحدات GC-MS مثل M7 Single Quadrupole GC-MS جنبا إلى جنب مع أجهزة قياس الطيف UV-Vis - كلها مدعومة عالميا من خلال فرق الخدمة التقنية ذات الخبرة.

ملخص للمعلومات الرئيسية حول بروتوكولات SEC

لا تزال الكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم لا غنى عنها بسبب بساطتها جنبا إلى جنب مع تنوعها عبر التخصصات - من علم البروتيوم إلى كيمياء البوليمرات.

منهجية متسقة - بما في ذلك إعداد العينات على النحو المناسب المعايرة - ضرورية للنتائج القابلة للتكرار.

يلعب اختيار الأدوات دورًا محوريًا: توفر حلول مثل تلك التي تقدمها Persee منصات قابلة للتوسع تلبي متطلبات تتراوح بين التحليل الروتيني وتطبيقات البحث المتطورة.

الأسئلة الشائعة:

Q1: ما هي أنواع الجزيئات التي يمكن تحليلها باستخدام الكروماتوغرافيا استبعاد الحجم؟
ج: الكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم مثالية لتحليل الجزيئات الكبيرة مثل البروتينات والبوليسكاريدات والأحماض النووية (الحمض النووي / الحمض النووي الريبي) والبوليمرات الاصطناعية والليغوسومات والجسيمات النانوية - حتى الجسيمات الفيروسية - في كل من البحوث والإعدادات الصناعية بسبب طبيعتها غير المدمرة القائمة فقط على اختلافات الحجم الهيدروديناميكي بدلا من التفاعلات الكيميائية.

س2: كيف يمكنني اختيار بين أنواع مختلفة من الكاشفات عند إعداد نظام SEC؟
ج: يعتمد اختيار الكاشف إلى حد كبير على نوع التحليل الخاص بك: يعمل UV-Vis بشكل جيد للمركبات الكروموفورية مثل البروتينات / الأحماض النووية ؛ مؤشر الانكسار يناسب الأنواع غير الكروموفورية مثل العديد من البوليمرات. يوفر تشتت الضوء كتلة مولارية مطلقة مستقلة عن المعايير - مما يجعلها قيمة عندما لا تكون منحنيات المعايرة ممكنة.

س3: لماذا يجب علي النظر في أدوات Persee لاحتياجاتي الكروماتوغرافية؟
ج: تقدم شركة بيرسي أجهزة معتمدة على ISO9001 مصممة حسب احتياجات المستخدم، بما في ذلك أنظمة L600 HPLC المتكاملة مع وحدات الكشف المتقدمة. وتضمن خبراتهم التي استمرت عقودا أداء قوي مدعوم ببنية تحتية عالمية للدعم تثق بها المختبرات في جميع أنحاء الأوساط الأكاديمية الصناعة بنفس القدر.