الكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم (SEC) هي طريقة مفيدة جدا. كما يعرف باسم الكروماتوغرافيا الترشيحية الهيلية. يستخدم لفصل الجزيئات بناء على حجمها في محلول. SEC مختلفة. يعمل على أساس فيزيائي وليس على التفاعلات الكيميائية مثل الطرق الأخرى. هذا يجعلها أداة خاصة وآمنة للعلماء. تشرح هذه المقالة الأفكار الأساسية للكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم. سننظر في سبب ظهور بعض الجزيئات أولاً ونرى كيف يتم استخدامها في العلوم. فهم كيفية عمل SEC يمكن أن يساعد حقا نتائج مختبرك، بغض النظر عما إذا كنت طالبا أو محترفا في التكنولوجيا الحيوية.
مبادئ الكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم
الكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم هي تقنية تصنف الجزيئات حسب حجمها الهيدروديناميكي بينما تمر بمرحلة ثابتة مسامية. هذه الطريقة شائعة جدا لتنقية البروتينات ودراسة البوليمرات والنظر إلى الجزيئات الحيوية. دعونا’ استكشاف الأفكار الرئيسية التي تفسر كيف تفصل SEC الأشياء.
كيف تفصل الكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم الجزيئات
أولا وقبل كل شيء ، يتم وضع عينة في عمود في SEC. يتم ملء هذا العمود بمواد مسامية. هذه هي في كثير من الأحيان حبات صغيرة من الاجاروز أو ديكستران أو السيليكا. ثم تتحرك العينة عبر العمود مع سائل يسمى المرحلة المتنقلة. الجزيئات تتم فصلها عن طريق ما إذا كانت يمكن أن تناسب مسام الخرز. الجزيئات الكبيرة لا تستطيع الدخول إلى المسام الصغيرة. لذلك ، تتحرك بسرعة أكبر بين الخرز. ومع ذلك، فإن الجزيئات الأصغر تأخذ مسار أطول لأنها تدخل المسام، لذلك تخرج في وقت لاحق. لتكون أكثر دقة، تفصل SEC الجزيئات بحجمها الهيدروديناميكي. هذه هي كمية المساحة التي يتناولها الجزيء في محلول. كل من الكتلة والشكل يؤثر على هذا الحجم. تفسر هذه الفكرة الأساسية لماذا تخرج الجزيئات بترتيب محدد في الكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم.
دور حجم المسام في المرحلة الثابتة
حجم المسام في المرحلة الثابتة هو جزء مهم جدا من SEC. تحتاج إلى اختيار المواد ذات أحجام المسام الصحيحة للجزيئات في عينتك. هذا هو المفتاح على سبيل المثال، يمكن لعمود SEC التحليلي القياسي في كثير من الأحيان فصل الجزيئات من 10 كيلو داتا إلى 600 كيلو داتا. هذه المجموعة رائعة للعديد من البروتينات الكروية. يتم ترك أي جزيئات أكبر من 600 كيلو داتا خارجًا تمامًا وتخرج أولًا في ما يسمى حجم الفراغ (V). ₀). من ناحية أخرى، تذهب الجزيئات الأصغر من 10 كيلو داتا إلى جميع المسام وتخرج أخيرا، بالقرب من حجم التسرب الكلي (V). ₜ). اختيار حجم المسام الصحيح يعطيك أفضل فصل. يسمح الفرق الواضح بين الأحجام الجزيئية.
الاختلافات بين استبعاد الحجم وتقنيات الكروماتوغرافيا الأخرى
SEC مختلفة تماما عن طرق الكروماتوغرافيا الأخرى. تقنيات مثل تبادل الأيونات أو الكروماتوغرافيا التقليدية تستخدم التفاعلات الكيميائية، مثل الشحنة أو الارتباط المحدد. لكن SEC تفصل الجزيئات فقط من خلال خصائصها الهيدروديناميكية. لا توجد تفاعلات كيميائية. ونتيجة لذلك ، فإن SEC لا’ يضر أو يغير الجزيئات الحيوية الحساسة مثل البروتينات. ما’ أكثر من ذلك ، فإن الطرق الأخرى مثل الكروماتوغرافيا في المرحلة العكسية غالباً ما تحتاج إلى المذيبات العضوية. عادة ما تستخدم SEC فقط العازلات القائمة على الماء. وهذا يجعله أكثر ملاءمة للعينات البيولوجية.
العوامل التي تؤثر على ترتيب التخلص
بعض الأشياء تلعب دورا في تعيين ترتيب الإحلال في الكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم. يجب التحكم في هذه العوامل بعناية للحصول على نتائج جيدة وقابلة للتكرار.
الحجم والشكل الجزيئي وتأثيرها على وقت التخلص
الشيء الرئيسي الذي يحدد وقت الإفلات في SEC هو الجزيء’ حجم هيدروديناميكي. إنه مفهوم بسيط. الجزيئات الأكبر يمكن’ t الدخول إلى مسام المرحلة الثابتة. بسبب هذا ، يأخذون رحلة أقصر عبر العمود ويخرجون أولاً. الجزيئات الأصغر يمكن أن تدخل المسام. لذلك ، يستغرق الأمر وقتًا أطولًا للوصول إلى الخارج في وقت لاحق. هذه العلاقة المعاكسة بين الحجم ووقت الإفلات هي ميزة رئيسية لـ SEC. كما أنه من المهم جداً معرفة أن الشكل الجزيئي مهم بقدر الكتلة. على سبيل المثال ، فإن البروتين الطويل النحيف من 100 كيلو داتا سيكون له حجم هيدروديناميكي أكبر من البروتين المستدير بنفس الكتلة ، لذلك سيخرج في وقت مبكر.
مواد التعبئة العمود وهيكل المسام
النوع من المواد المستخدمة لتعبئة العمود وهيكله المسامي له تأثير كبير على مدى فصل الأشياء بشكل جيد. تحصل على نتائج أفضل مع المواد التي لها أحجام مسام متسقة جدا. إذا لم يكن هيكل المسام متساويًا ، يمكن أن تنتشر ملفات تعريف الإفلات وتتداخل. هذا سيء على سبيل المثال، غالبا ما تستخدم المواد القائمة على السيليكا الصلبة في وظائف عالية الأداء مع جزيئات أصغر. على النقيض من ذلك ، عادة ما تكون الجيلات القائمة على الاجاروز المترابطة هي الخيار الأفضل للجزيئات الحيوية الكبيرة مثل البروتينات والأجسام المضادة.
معدل التدفق وتكوين المرحلة المتنقلة
وتؤثر معدل تدفق المرحلة المتنقلة أيضًا على كيفية خروج الجزيئات. معدل تدفق أبطأ يعطي الجزيئات الأصغر وقتًا أكبر للذهاب إلى المسام. وهذا يحسن الفصل. ولكن هذا يجعل العملية بأكملها تستغرق وقتًا أطول. يجب اختيار المرحلة المتنقلة ، وعادة ما تكون عازلة ، بعناية لوقف أي تفاعلات غير مرغوب فيها بين العينة والمرحلة الثابتة. وهذا يضمن أن الفصل يعتمد فقط على الحجم. وكذلك، غالبا ما يتم إضافة الكمية الصحيحة من الملح (على سبيل المثال، 150 ملم NaCl) لوقف أي تفاعلات كهربائية عشوائية.
سلوك التخلص من الجزيئات
لماذا تظهر الجزيئات الكبيرة قبل الجزيئات الأصغر
في الكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم، الجزيئات الكبيرة تخرج أولاً. يحدث هذا لأنها تبقى خارج المسام في المرحلة الثابتة. لا يمكنهم الدخول إلى داخل الخرز. وبالتالي ، فهي تتحرك فقط من خلال حجم الفراغ ، وهو الفضاء بين الخرز. هذه هي أسرع طريقة لنهاية العمود. لكن الجزيئات الأصغر مختلفة. يمكنهم الدخول إلى المسام. هذا يجعل مسارهم أطول ويزيد من الوقت الذي يبقون فيه في العمود.
مسارات عبر مصفوفة العمود لأحجام الجزيئات المختلفة
يعتمد المسار الذي يتبعه الجزيء عبر العمود على حجمه مقارنة بحجم المسام.
- الجزيئات الكبيرة (الاستبعاد الكامل): هذه تتجنب تماما المسام. إنها تتحرك فقط عبر المساحات بين الخرز.
- جزيئات متوسطة الحجم (إدراج جزئي): هذه يمكن أن تذهب إلى بعض المسام. هذا يؤدي إلى أوقات التخلص المتوسطة.
- الجزيئات الصغيرة (إدراج كامل): هذه يمكن أن تصل إلى كل مساحة المسام. وهذا يؤدي إلى أطول مسار وأحدث التسرب.
قيود الفصل على أساس التشابه الجزيئي
SEC هو طريقة جيدة جدا. ولكن لديها صعوبة في فصل الجزيئات التي هي تقريبا نفس الحجم والشكل. عندما يحدث هذا ، يمكن أن تتداخل أوقات التخلص. والنتيجة هي الفصل السيئ. يحتاج العلماء إلى تذكر هذه الحدود عند تخطيط تجاربهم وتحليل بياناتهم.
تطبيقات الكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم
تنقية البروتين وتحليله
أحد الاستخدامات الأكثر شيوعا من SEC هو لتنقية البروتين. يعمل بشكل جيد جدا لفصل البروتينات الفردية من الكتل أو الشوائب الأصغر. كما يستخدم لدراسة مجموعات البروتين ومعرفة حالاتها الأوليغوميرية. هذا يعطي معلومات مهمة عن كيفية عملها في الجسم.
توصيف البوليمر
في عالم علوم المواد ، يستخدم SEC للعثور على توزيع الوزن الجزيئي للبوليمرات. هنا ، غالبا ما يسمى الجيل كروماتوغرافيا التخلص (GPC). هذه المعلومات مهمة جدا لمعرفة البوليمر’ الخصائص الفيزيائية.
فصل الجزيئات الحيوية في البحوث الصيدلانية
في أبحاث الأدوية ، تعد SEC أداة رئيسية لمراقبة جودة الأدوية البيولوجية ، مثل الأجسام المضادة الأحادية المستنسخة (mAbs) ، الإنزيمات ، والأحماض النووية. ولها دور كبير في إنشاء أدوية جديدة عن طريق قياس الكتل الكبيرة والقطع الصغيرة. هذا يضمن أن الدواء النهائي نقي ومستقر.
الاعتبارات الرئيسية لتحقيق نتائج دقيقة
المعايرة بمعايير الوزن الجزيئي
لقياس الحجم الجيد ، يجب عليك أولاً معايرة النظام. ويتم ذلك بمعايير الوزن الجزيئي. من خلال تشغيل المعايير المعروفة، يمكن للعلماء صنع منحنى المعايرة. هذا المنحنى يرسم حجم الإفلات ضد سجل الوزن الجزيئي. بالنسبة للبروتينات ، تشمل مجموعة شائعة من المعايير ثيروغلوبولين (~ 670 kDa) ، غلوبولين γ (~ 158 kDa) ، ألبومين مصل البقر (BSA ، ~ 66 kDa) ، البيضاوي (~ 44 kDa) ، والميوغلوبين (~ 17 kDa). هذه الخطوة حيوية لتخمين الوزن الجزيئي للعينات المجهولة.
أهمية اختيار العمود وصيانته
اختيار العمود الصحيح مع نطاق حجم المسام الصحيح مهم. كما تحتاج إلى الاهتمام به. الصيانة المنتظمة ، مثل تنظيفه وتخزينه بشكل صحيح ، تساعد العمود على استمرار فترة أطول وتعمل بشكل جيد في كل مرة.
تقنيات تحضير العينات
إعداد العينة مهمة جدا أيضا. العنقود أو العينات المكسورة يمكن أن تفسد النتائج. يمكن أن تساعد أشياء مثل تصفية أو تدوير العينة للتخلص من الجسيمات. باستخدام العازلات التي تبقي العينة مستقرة يمكن أيضا وقف التكتل. هذه الخطوات تتأكد من الحصول على بيانات جيدة من SEC.
PERSEE: مصنع موثوق للأدوات التحليلية
عندما تحتاج إلى أدوات تحليلية جيدة للكروماتوغرافيا، برسي اسم يمكنك الثقة به. تساعد معرفتهم ومنتجاتهم الجديدة العلماء على الحصول على نتائج دقيقة وقابلة للتكرار.
نظرة عامة على خبرة PERSEE في حلول الكروماتوغرافيا
PERSEE هو اسم معروف للأدوات التحليلية. لقد بنوا سمعة كرائد في هذا المجال. هم تقدم العديد من الحلول المختلفة فقط لاستخدامات الكروماتوغرافيا. غالبا ما تختارها المختبرات التي تقوم بالكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم بسبب تركيزها على الجودة والأفكار الجديدة. يوفر PERSEE للعلماء الأدوات التي يحتاجونها للبحوث المتقدمة. منتجاتها سهلة الاستخدام وبنيت لتستمر.
تسليط الضوء على نظام الكروماتوغراف السائل L600 عالي الأداء
إن نظام الكروماتوغراف السائل عالي الأداء L600 هو منتج رائع من PERSEE. إنه مصنوع للتعامل مع احتياجات اليوم’ مختبرات مشغولة.
- الميزات التي تدعم الدقة العالية والقدرة على التكرار: نظام L600 لديه ميزات رائعة. وتشمل هذه التحكم الدقيق في التدفق، والكاشفات الحساسة للغاية، والإعدادات التي يمكنك تغييرها. هذا يضمن دقة مذهلة في عمل الكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم. بناء قوي يعني أيضًا أقل اختلافًا ، مما يعطيك نتائج يمكنك الاعتماد عليها.
- التطبيقات عبر مجالات التكنولوجيا الحيوية والصيدلانية والبحوث الأكاديمية: يمكن لنظام L600 القيام بالعديد من المهام. يساعد في الكثير من المهام المختلفة في التكنولوجيا الحيوية والصيدلانية والبحوث الجامعية. يقدم نتائج قوية سواء كنت تنقي البروتينات أو تدرس البوليمرات أو تحليل الجزيئات الحيوية. تظهر مرونته مدى اهتمام PERSEE بتحسين الكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم.
ملخص الأفكار الرئيسية
ترتيب التخلص من الجزيئات هو الميزة الرئيسية للكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم. الجزيئات الكبيرة تخرج أولاً. ويرجع ذلك إلى أنها مستبعدة من المرور داخل مسام المرحلة الثابتة ولديها مسافة أقصر. الجزيئات الأصغر يمكن أن تخترق المسام. وهذا يعطيهم مسار أطول، وبالتالي يهربون في وقت لاحق. الحفاظ على هذه القاعدة السهلة في ذهنك هو المفتاح لإجراء تجارب جيدة وإيجاد معنى لبيانات المختبر الخاصة بك.
الأسئلة الشائعة
Q1: ما الذي يجعل SEC طريقة مفضلة لتنقية البروتين؟
ج: يفضل SEC لتنقية البروتينات لأنه يفصل البروتينات حسب حجمها في حالتها الأصلية دون استخدام مواد كيميائية متطرفة. إنها عملية لطيفة. وهذا يعني أن البروتينات نشطة ووظيفية. بالإضافة إلى ذلك ، أدى SEC بشكل جيد بشكل استثنائي في إزالة تجمعات البروتين ، والتي لها أهمية كبيرة جدا لجودة الأدوية البروتينية.
س2: كيف يمكنني تحسين القرار في تجارب SEC؟
ج: للحصول على فصل أفضل ، يمكنك القيام بعدد من الأشياء:
- استخدم عمود مع حبات أصغر وحجم مسام جيد لعينتك.
- استخدم عمود أطول، مما يعطي الجزيئات مساحة أكبر للتحرك.
- خفض معدل التدفق. وهذا يعطي الجزيئات المزيد من الوقت لقضاء مع المرحلة الثابتة.
س3: هل الكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم مناسبة لجميع أنواع الجزيئات؟
ج: لجنة الأوراق المالية والبورصات قيمة جدا، لكنها’ أفضل عندما تكون الجزيئات بأحجام مختلفة. قد تجد صعوبة في فصل الجزيئات ذات الأحجام الهيدروديناميكية المتشابهة للغاية. إذا كنت’ بعد وجود هذه المشكلة ، يمكنك محاولة استخدام SEC بالاقتران مع طرق أخرى (مثل الكروماتوغرافيا بتبادل الأيونات) للحصول على الفصل الذي تحتاجه.
